NF-κB信號通路對腦出血后自噬及細(xì)胞死亡的影響.pdf

1、目的：研究腦出血后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)規(guī)律、研究阻斷NF-κB信號通路對腦出血后自噬激活及細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞的影響,并對其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法：體內(nèi)試驗(yàn)。采用紋狀體部位注射膠原酶Ⅳ法建立小鼠腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)模型,建立模型前5 min分別側(cè)腦室注射SN50(NF-κB的特異性抑制劑,0.1μg/1μ1)或等體積生理鹽水,腦出血對照組不做任何預(yù)處理直接建立模型,同時(shí)設(shè)立空白

2、對照組。各組按出血后時(shí)間不同分為出血后1 h,6 h,24 h,48 h和7 d組,各組分別于處死前1 h用腹腔注射法將碘化丙啶(propidium iodide,PI)注入各組小鼠體內(nèi),采用體視學(xué)顯微鏡分別計(jì)數(shù)各組出血中央?yún)^(qū)及出血周邊區(qū)PI陽性細(xì)胞數(shù),研究腦出血后細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞的變化規(guī)律以及阻斷NF-κB對腦出血引起的細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞的影響；采用Motor Test評估腦出血后各組動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能；運(yùn)用Western blot法和

3、免疫組織熒光法觀察腦出血后各組腦組織中自噬相關(guān)蛋白LC3,Bcl-2,Beclin-1的表達(dá)情況。體外實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞。傳代時(shí)將細(xì)胞分為三組：一組培養(yǎng)基中加入Hemin,一組培養(yǎng)基中加入Hemin的同時(shí)加入SN50,各組于24 h、48 h后終止培養(yǎng),收集細(xì)胞。同時(shí)設(shè)立空白對照組。Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1、Bcl-2的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：與正常小鼠相比,腦出血后PI陽性細(xì)胞數(shù)

4、隨時(shí)間變化逐漸增多,其中出血中央?yún)^(qū)陽性細(xì)胞數(shù)高峰出現(xiàn)在48 h時(shí)、出血周邊區(qū)24 h時(shí)達(dá)高峰。至7 d時(shí)細(xì)胞死亡數(shù)目達(dá)穩(wěn)定(均P<0.05)。免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腦出血后Beclin-1蛋白表達(dá)增多,Bcl-2蛋白表達(dá)下降,但Beclin-1/Bcl-2比值升高；LC3蛋白表達(dá)顯著增加(均P<0.05)；與鹽水處理組相比,SN50處理組小鼠腦出血后出血周邊區(qū)PI陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯減少,出血中央?yún)^(qū)PI陽性細(xì)胞24 h-48 h時(shí)顯著減少(

5、P<0.05),至7 d時(shí)已無明顯減少。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與鹽水處理組相比,SN50處理組腦出血后運(yùn)動(dòng)功能無明顯改善,免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SN50促進(jìn)了Beclin-1表達(dá)的增加,Bcl-2蛋白表達(dá)先下降后升高,Beclin-1/Bcl-2比值升高,增強(qiáng)了腦出血誘導(dǎo)的LC3表達(dá)的激活(均P<0.05)；PC12細(xì)胞免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:SN50促進(jìn)了Hemin誘導(dǎo)的LC3的表達(dá)上調(diào)；促進(jìn)了Beclin-1表達(dá)的上調(diào),逆轉(zhuǎn)了Hemin誘

6、導(dǎo)的Bcl-2的下調(diào),Beclin-1/Bcl-2比值增加(均P<0.05)。
　　 結(jié)論：腦出血可以造成細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞,腦出血后24 h～48 h質(zhì)膜完整性遭破壞的細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰,表現(xiàn)為PI陽性細(xì)胞顯著增多；SN50可以暫時(shí)緩解腦出血造成的出血中央?yún)^(qū)的細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞,但對延遲性的細(xì)胞死亡無明顯作用。腦出血后自噬被激活,自噬部分參與了腦出血引起的細(xì)胞死亡；SN50能夠促進(jìn)腦出血后自噬的激活,這種激活至少部分通過Becli