卵巢癌鉑類耐藥相關(guān)蛋白Annexin A3在人外周血臨床檢測的可行性研究.pdf

1、背景和目的：
　　 卵巢癌患者的外周血中也檢測出Annexin A3蛋白的表達(dá)，充分證實(shí)Annexin A3是一個(gè)可分泌蛋白。
　　 本研究旨在前期工作的基礎(chǔ)上探討利用ELISA法在外周血定量檢測AnnexinA3蛋白的可行性。分析Annexin A3蛋白在正常婦女、卵巢良性腫瘤患者及卵巢癌患者外周血中的分布及表達(dá)水平，并初步探討卵巢癌患者外周血表達(dá)水平與卵巢癌鉑類耐藥的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1.

2、研究對象：連續(xù)入選于2009年12月至2010年2月期間在北京協(xié)和醫(yī)院體檢及就診的健康婦女、卵巢良性腫瘤和卵巢癌患者。
　　 健康婦女入選標(biāo)準(zhǔn)：納入婦科體格檢查、宮頸細(xì)胞學(xué)檢查及婦科超聲檢查均無異常，并同時(shí)進(jìn)行了血清CA125檢測的婦女，排除既往有卵巢腫瘤或婦科及全身惡性腫瘤的婦女。年齡與卵巢癌患者匹配。
　　 卵巢良性腫瘤入選標(biāo)準(zhǔn)：在北京協(xié)和醫(yī)院住院手術(shù)治療的患者，病理診斷明確，術(shù)前進(jìn)行了血清CA125檢測。
　

3、　 卵巢癌患者入選標(biāo)準(zhǔn)：在北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科治療及隨診，病理診斷為卵巢原發(fā)上皮癌，進(jìn)行了血清CA125的檢測，排除合并其它婦科或全身惡性腫瘤的患者。卵巢癌耐藥病例包括耐藥性和難治性卵巢癌。耐藥性卵巢癌為，初次化療有效，但?；?個(gè)月以內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)。難治性卵巢癌為，初次化療時(shí)疾病進(jìn)展或持續(xù)存在。將二者作為鉑耐藥性卵巢癌。
　　 2.標(biāo)本及臨床資料收集：全部標(biāo)本來自北京協(xié)和醫(yī)院進(jìn)行血清CA125檢測的剩余血清，檢測后于4℃冷庫內(nèi)保存

4、。7天之內(nèi)將血清樣本分裝到0.5mL Eppendorf中，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存。在測量前判、時(shí)一次化凍。詳細(xì)記錄同一樣本的血清CA125水平以及所有對象相應(yīng)的臨床資料。
　　 3.采用ELISA方法檢測上述樣本外周血清Annexin A3的濃度。每份樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值求得測定值。對于檢測過程的質(zhì)量控制措施包括：制定標(biāo)準(zhǔn)的操作程序，培訓(xùn)操作人員，一次性完成測定，在臨床檢驗(yàn)專家的指導(dǎo)下設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨機(jī)插入已知蛋白濃

5、度的質(zhì)控品，被檢樣品的隨機(jī)上樣，以及采用雙波長測定吸收值等。
　　 4.采用回顧性分析的方法，分層分析臨床卵巢上皮癌化療敏感和耐藥病例的各生物學(xué)變量與Annexin A3蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性；分析卵巢上皮癌患者的無鉑化療間期與Annexin A3蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　 5.采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用Crubbs氏法對ELISA測定進(jìn)行質(zhì)控檢驗(yàn)。Kolmogorov-Smirnov非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)控

6、品光密度及樣本的正態(tài)性檢驗(yàn)。兩組正態(tài)分布獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)。兩組非正態(tài)分布獨(dú)立樣本比較利用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)。多組非正態(tài)分布獨(dú)立樣本比較利用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.連續(xù)收集病例共計(jì)271例。其中，健康婦女102例，年齡范圍31-78歲，中位年齡52歲。卵巢良性腫瘤患者47例，年齡范圍17-61歲，中位年齡36歲。卵巢癌患者122例，包括化療敏感病人63例，

7、耐藥病人59例；年齡范圍31-81歲，中位年齡53歲。卵巢癌患者與健康婦女的年齡無顯著性差異；與卵巢良性腫瘤患者的年齡有顯著性差異（p<0.05）。
　　 2.271份標(biāo)本共使用10個(gè)96孔板。經(jīng)Crubbs氏法質(zhì)控檢驗(yàn)，第1～9板符合質(zhì)控要求，第10板不符合質(zhì)控要求。舍棄板10數(shù)據(jù)，共計(jì)26份標(biāo)本，包括卵巢良性腫瘤8例以及健康婦女18例。Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對質(zhì)控品光密度進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，三個(gè)濃度p值分別為0

8、.919，0.751，0.931，均符合正態(tài)分布。并去除標(biāo)準(zhǔn)曲線以外的極端大值6例和極端小值8例。
　　 3.在臨床全部271份的血清樣本中均可以檢測到Annexin A3蛋白的表達(dá)。去掉極端值及質(zhì)控不合格值后，共有樣本231份進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)Kolmogorov-smirnov檢驗(yàn)，卵巢良性腫瘤患者Annexin A3測定值為正態(tài)分布，p=0.387。健康婦女和卵巢癌患者Annexin A3非正態(tài)分布，P值分別為0.028，0

9、.007。在健康婦女血清中的
　　 Annexin A3表達(dá)范圍在0.261-4.74ng/mL，平均值0.867ng/mL，中位數(shù)0.709ng/mL。卵巢良性腫瘤患者Annexin A3蛋白的表達(dá)范圍在0.263-2.46ng/mL，平均值0.815ng/mL，中位數(shù)0.740ng/mL。卵巢癌患者Annexin A3蛋白的表達(dá)范圍在0.201-2.84ng/mL，平均值0.689ng/mL，中位數(shù)0.567ng/mL。經(jīng)K

10、ruskal-Wallis檢驗(yàn)，三組相比無顯著性差異。分析研究對象血清Annexin A3的表達(dá)水平與CA125測定值的相關(guān)性。將健康婦女血清CA125值分為<10U/mL和≥10U/mL兩組，Annexin A3的表達(dá)水平無明顯差別。將卵巢良性腫瘤患者血清CA125值分為<35U/mL和≥35U/mL兩組，Annexin A3的表達(dá)水平也無明顯差別。將卵巢癌患者血清CAl25值分為<100U/mL和≥100U/mL兩組，前者的Anne

11、xin A3的測定平均值為0.645 ng/mL，后者平均值為0.840 ng/mL，兩組的表達(dá)水平有顯著性差別（p=0.043）。
　　 4.根據(jù)卵巢上皮癌患者末次化療的時(shí)間將研究對象分為化療敏感和耐藥兩組。按照患者的年齡、血清CA125水平、FIGO分期、腫瘤的病理學(xué)類型、分化程度、以及鉑化療的療程總數(shù)等生物學(xué)變量進(jìn)行分層，兩組之間Annexin A3蛋白的表達(dá)水平均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差別。進(jìn)一步根據(jù)卵巢癌患者末次鉑類化

12、療的時(shí)間統(tǒng)計(jì)無鉑化療間期，分為≤6個(gè)月和>6個(gè)月兩組，按照Annexin A3的表達(dá)水平的測定值分層，取所采用試劑盒建議的標(biāo)曲范圍最小值0.8ng/mL為上限，以0.2ng/mL為一個(gè)層間距，至試劑盒的最小分辨度為0.2ng/mL為下限，共分為4層。分析表明，伴隨分層Annexin A3基礎(chǔ)數(shù)值的遞增，兩組Annexin A3測定值的的平均值和中位數(shù)平行線性上升。至Annexin A3≥0.6ng/mL層時(shí)，兩個(gè)組Annexin A3表

13、達(dá)水平同步進(jìn)入正態(tài)分布區(qū)間，采用t檢驗(yàn)對兩組間的平均值進(jìn)行比較。在Annexin A3≥0.6ng/mL層，Annexin A3的均值，無鉑化療間期≤6個(gè)月組為1.17±0.615ng/mL：>6個(gè)月組為0.924±0.250 ng/mL，p=0.048。在AnneixnA3≥0.8ng/mL層，AnnexinA3的均值，無鉑化療間隔≤6個(gè)月組為1.44±0.647ng/mL；>6個(gè)月組水平為1.07±0.214 ng/mL，p=0.0

14、28。由于兩組的方差齊性檢驗(yàn)P值均<0.05，進(jìn)一步采用t’檢驗(yàn)，獲得對Annexin A3均值檢驗(yàn)的P值，在Annexin A3≥0.6ng/mL層，p=0.095；在Annexin A3≥0.8ng/mL層，p=0.070；統(tǒng)計(jì)學(xué)十分接近顯著性差別。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究首次連續(xù)收集較大量的臨床標(biāo)本開展卵巢癌鉑類耐藥相關(guān)蛋白Annexin A3在人外周血中檢測的研究。共收集健康婦女102例，卵巢良性腫瘤患者

15、47例，卵巢癌患者122例，共計(jì)271例研究對象。
　　 2.采用ELISA法可以完成對Annexin A3蛋白在人外周血清中表達(dá)的高通量定量檢測。在臨床全部271份的血清樣本中均檢測到Annexin A3蛋白的表達(dá)，健康婦女和卵巢癌患者Annexin A3非正態(tài)分布。有超過150例標(biāo)本的測定值低于建議標(biāo)曲范圍的最小值0.8ng/mL，表明現(xiàn)有ELISA試劑盒的敏感性欠佳。開發(fā)更加敏感的檢測方法可以完善對Annexin A3蛋白

16、在人外周血中檢測的研究。
　　 3.現(xiàn)有樣本中，Annexin A3蛋白在健康女性、卵巢良性腫瘤患者和卵巢上皮癌患者外周血清中的表達(dá)無顯著性差異。Annexin A3蛋白的表達(dá)與健康女性和卵巢良性腫瘤患者外周血中CA125水平無明顯相關(guān)性；而與卵巢上皮癌患者外周血中高水平CA125的表達(dá)有關(guān)，提示Annexin A3蛋白可能是卵巢癌特異性相關(guān)蛋白。本研究中卵巢癌患者Annexin A3蛋白的測定值在直觀上低于健康女性和卵巢良性腫

17、瘤患者，可能與前者均為術(shù)后化療或化療后隨訪的病例，其腫瘤負(fù)荷大大降低有關(guān)。檢測卵巢癌患者術(shù)前或化療前血清Annexin A3蛋白水平將有助于證明Annexin A3蛋白能否成為卵巢癌鉑類耐藥標(biāo)記蛋白。
　　 4.本研究表明，根據(jù)卵巢上皮癌患者末次化療的時(shí)間將研究對象分為化療敏感和耐藥兩組，按照患者的年齡、血清CA125水平、FIGO分期、腫瘤的病理學(xué)類型、分化程度、以及鉑化療的療程總數(shù)等生物學(xué)變量進(jìn)行分層，兩組之間Annexin