Dlk2在骨骼肌發(fā)育中的作用研究.pdf

1、Dlk2(Delta-like2 homolog)屬EGF樣跨膜蛋白，與同家族成員Dlk1(Delta-like1 homolog)高度同源。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Dlk1在包括脂肪生成和肌肉生成在內(nèi)的多個(gè)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。但是目前對(duì)Dlk2的研究還主要限于脂肪生成過程，迄今為止尚未見Dlk2在骨骼肌生成方面的報(bào)道。
　　本研究首次考察了Dlk2在骨骼肌發(fā)育中的作用。首先，通過檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期的雞骨骼肌組織中cDLK2的表達(dá)水平，我們

2、發(fā)現(xiàn)其在胚胎骨骼肌發(fā)育早期較高，而隨發(fā)育的進(jìn)行逐漸降低并在出殼后維持較低水平，說(shuō)明Dlk2可能在胚胎骨骼肌早期發(fā)育中發(fā)揮作用。接著，我們利用小鼠成肌細(xì)胞系C2C12模型發(fā)現(xiàn)，Dlk2在成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化前表達(dá)水平較高，而在誘導(dǎo)分化后大幅下降，進(jìn)一步說(shuō)明Dlk2涉及到成肌分化過程中。敲低Dlk2后不影響C2C12早期成肌分化，但顯著削弱了肌管的融合，說(shuō)明中晚期成肌分化受到抑制。過表達(dá)Dlk2對(duì)C2C12的早期成肌分化基因的表達(dá)也沒有顯著影響

3、，但同樣抑制中晚期分化。這種矛盾暗示了Dlk2可能在調(diào)控骨骼肌生成方面具有雙重作用。進(jìn)一步分析Dlk2在誘導(dǎo)分化前成肌細(xì)胞中的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞的密度可以負(fù)調(diào)控Dlk2表達(dá)，鑒于成肌細(xì)胞密度與其定向肌細(xì)胞分化潛能密切相關(guān)，我們推測(cè)Dlk2可能參與維持成肌細(xì)胞的分化潛能。
　　為研究Dlk2調(diào)控成肌細(xì)胞分化的分子機(jī)制，首先我們?cè)贑2C12細(xì)胞中考察了Dlk2與Notch信號(hào)通路之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)雖然過表達(dá)Dlk2引起Notch通路

4、下游響應(yīng)基因Hey1的表達(dá)水平顯著上調(diào)，但這并不是由Notch1信號(hào)的激活造成的?？疾炝硪粋€(gè)影響Hey1的信號(hào)通路——BMP通路，我們發(fā)現(xiàn)Hey1的上調(diào)也不是經(jīng)由BMP-Smad1/5/8信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。因此我們推測(cè)Dlk2可能不通過Notch或BMP信號(hào)通路調(diào)控骨骼肌生成。另一方面，過表達(dá)Dlk2導(dǎo)致IGF通路基因Igf2表達(dá)水平顯著下調(diào)，而Igfbp2和Igfbp5表達(dá)水平顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Dlk2可以與IGFs受體IGF-IR直

5、接結(jié)合并抑制IGF-Akt信號(hào)活性，施加外源IGF-Ⅱ蛋白可以恢復(fù)過表達(dá)Dlk2 C2C12細(xì)胞的分化能力，說(shuō)明Dlk2能夠經(jīng)由IGF-Akt通路調(diào)控骨骼肌生成。
　　接下來(lái)我們利用小鼠肌肉損傷修復(fù)模型檢測(cè)了骨骼肌再生過程中Dlk2的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)在此過程中Dlk2的表達(dá)明顯上調(diào)，并且其表達(dá)模式與Pax7高度相似，表明Dlk2參與了骨骼肌再生的早期階段。最后我們成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了zDlk2敲除的斑馬魚，通