重配制備B型流感病毒Vero細胞適應毒株及無血清微載體培養(yǎng)流感病毒的研究.pdf

1、流行性感冒（簡稱流感）是由流感病毒（influenza virus）引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒能在短時間內(nèi)突然爆發(fā)，造成不同程度地流行，且可以在各個年齡段的人群中引起發(fā)病。接種流感疫苗是預防和控制流感的最有效方法。傳統(tǒng)以雞胚為基質(zhì)生產(chǎn)流感疫苗存在諸多不足，難以在短時間內(nèi)為生產(chǎn)疫苗提供大量的雞胚。用哺乳動物細胞生產(chǎn)疫苗具有很大的優(yōu)勢，細胞生產(chǎn)的過程更快，更容易質(zhì)量控制以及更大規(guī)模的生產(chǎn)。Vero細胞是WHO推薦用于疫苗生產(chǎn)的細胞基質(zhì)

2、。無血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外正常生長繁殖的合成培養(yǎng)基，其克服了含血清培養(yǎng)存在潛在污染源及不利于下游分離純化等缺點。另外，微載體培養(yǎng)細胞增加了細胞和病毒的產(chǎn)量，使大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。本實驗首先采用傳統(tǒng)的流感病毒重配方法，獲得一株流感病毒Vero細胞適應株，然后在攪拌瓶中利用無血清微載體培養(yǎng)Vero細胞和流感病毒，通過對一系列培養(yǎng)條件的優(yōu)化，從而得到了無血清微載體培養(yǎng)Vero細胞接種流感病毒的適宜條件。
　　

3、一、重配制備B型流感病毒Vero細胞適應株
　　 以流感病毒Vero細胞適應株B/Yunnan/02/2005Va，（B）為母本株，與WHO推薦的2006～2008年疫苗株B/Malaysia/2506/2004共同感染雞胚和Vero細胞，用抗血清B/Yunnan/02/2005Va（B）篩選重配病毒，在Vero細胞連傳10代，空斑純化重配流感病毒，繼續(xù)在Vero細胞連傳8代，血凝抑制試驗、免疫熒光試驗、單向免疫瓊脂擴散試驗表明

4、重配病毒與B/Malaysia/2506/2004是同系，基因測序后分析證明含有B/Malaysia/2506/2004的HA和NA。從而篩選出一株B型流感病毒Vero細胞適應：B/Malaysia/2506/2004Val（B）。
　　 二、無血清微載體培養(yǎng)Vero細胞和B型流感病毒條件的優(yōu)化
　　 在攪拌瓶中采用不同的細胞接種量和不同的微載體濃度培養(yǎng)Vero細胞并接種流感病毒，選擇適宜的細胞和微載體濃度，并檢測不同的

5、pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接種量、病毒收獲時間及病毒收獲方法，對流感病毒血凝滴度的影響。結(jié)果以1～5×105個/ml的Vero細胞接種至濃度為3 mg/ml的無血清微載體中，病毒培養(yǎng)液pH值為7.2，TPCK-胰酶含量為1.0μg/ml，病毒接種量為1.0 MOI，并在感染48h后補加TPCK-胰酶，培養(yǎng)72h后收獲上清與細胞內(nèi)病毒，超聲破碎細胞獲取病毒，血凝滴度可達1:512。從而獲得了無血清培養(yǎng)基微載體培養(yǎng)Vero細胞和流感病