高膽固醇血癥患者LDL-R、CETP、PCSK9基因多態(tài)性分析.pdf

1、高膽固醇血癥是一種以血清膽固醇水平升高為主要特征的脂類代謝異常疾病，屬于Ⅱα型高脂蛋白血癥。其主要表現(xiàn)為血清膽固醇水平的升高，導(dǎo)致膽固醇在血管聚集，形成動脈粥樣硬化，大量的臨床及流行病學(xué)研究已經(jīng)證明脂質(zhì)代謝異常與冠心病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。而且已經(jīng)證實(shí)血清總膽固醇水平升高是冠心病發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素，也是冠心病患者冠狀動脈事件增加的重要危險(xiǎn)因素。
　　 本課題的第一部分應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)

2、，觀察不同程度高膽固醇血癥患者LDL-R基因XspⅠ、ClaⅠ和HinfⅠ多態(tài)位點(diǎn)的分布，揭示LDL-R基因的多態(tài)性與高膽固醇血癥之間的相互關(guān)系。
　　 人類CETP能介導(dǎo)血漿膽固醇酯和甘油三酯在高密度脂蛋白（HDL-c）和含載脂蛋白B的脂蛋白，如LDL-c和極低密度脂蛋白（VLDL-c）之間的交換，通過這種交換，CETP能調(diào)節(jié)血漿HDL-c的濃度、組成和顆粒的大小，在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)即膽固醇從外周組織流出運(yùn)輸至肝臟的過程中起著關(guān)

3、鍵的作用，所以CETP是血漿HDL-c和LDL-c水平高低的主要決定因素之一，也是動脈粥樣硬化的易感基因之一。已發(fā)現(xiàn)CETP基因的許多位點(diǎn)存在基因多態(tài)性，有研究認(rèn)為CETP與HDL-c呈負(fù)相關(guān)，與LDL-c呈正相關(guān)，也有研究則認(rèn)為CETP與HDL-c、LDL-c的關(guān)系不能確定，還有研究發(fā)現(xiàn)CETP與HDL-c無關(guān)，而與TC或LDL-c關(guān)系密切。CETP在高膽固醇血癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚不清楚，本課題的第二部分試圖揭示CETP基因T

4、oqⅠB多態(tài)性、D442G突變與高膽固醇血癥之間的相互關(guān)系。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn)PCSK9是引起高膽固醇血癥的第三個原因，它的作用已經(jīng)引起了人們的注意。PCSK9是編碼前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的一員，一些占優(yōu)勢的功能獲得型突變與高膽固醇血癥密切相關(guān)，甚至與非常嚴(yán)重的家族性高膽固醇血癥（FH）樣表型有關(guān)。正常情況下PCSK9的表達(dá)可以下調(diào)LDL-R的表達(dá)，間接引起LDL-R蛋白的降解，所以功能獲得型突變引起血漿LDL-c的升高，而功能缺

5、失型突變引起血漿LDL-c水平的下降。這就是本課題第三部分所關(guān)注的問題。
　　 第一部分 LDL-R基因多態(tài)性分析與高膽固醇血癥的相關(guān)性研究
　　 目的：通過采用PCR-RFLP技術(shù)對高膽固醇血癥人群LDL-R基因已知的XspⅠ、ClaⅠ和HinfⅠ多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行研究，比較它在不同程度的高膽固醇血癥患者及對照人群中的分布，揭示LDL-R基因的多態(tài)性與高膽固醇血癥之間的相互關(guān)系。
　　 方法：1568例膽固醇異?；颊?/p>

6、均來自該院體檢中心查體者，按照2007年“中國成人血脂異常防治指南”中臨床分型標(biāo)準(zhǔn)，分為兩組：（1）高膽固醇血癥組（HC組）994例；（2）邊緣高膽固醇血癥組（BHC組）574例。同時期健康體檢者374例作為對照組（NC組），年齡、性別均匹配。血脂異常均為初次診斷，且未用任何降脂藥物，所有研究對象經(jīng)血、尿、便常規(guī)、心電圖、B超等檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。且所有受試對象均除外甲狀腺功能亢進(jìn)癥、甲狀腺機(jī)能減退、慢性肝病、糖尿病、糖尿病腎病、腎病綜合

7、癥、腎移植術(shù)后等影響脂類代謝的疾病，排除應(yīng)用影響糖脂代謝藥物者。受試者均測量身高和體重，計(jì)算體重指數(shù)（BMI），檢測空腹血清TC、甘油三酯（TG）、HDL-c、LDL-c、VLDL-c水平；取4ml EDTA-K2抗凝血，提取基因組DNA，引物設(shè)計(jì)采用生物學(xué)軟件Primer5.0，并與GenBank進(jìn)行比對。采用PCR和RFLP方法擴(kuò)增目的基因片段，進(jìn)行多態(tài)性分析。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都在SPSS13.0軟件包中完成。用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻率

8、和基因型頻率；各統(tǒng)計(jì)指標(biāo)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示；不同程度高膽固醇組和對照組間統(tǒng)計(jì)指標(biāo)的比較采用t檢驗(yàn)；不同程度高膽固醇組和對照組間基因型頻率和等位基因頻率的差異用x2檢驗(yàn)；在不同基因型中各個臨床參數(shù)比較采用方差分析，組與組之間采用單基因方差分析；并通過Logistic回歸分析LDL-R基因和血清膽固醇水平升高的關(guān)系。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 小結(jié)：
　　 1.血漿TC、LDL、HDL水平與LD

9、L-R基因XspⅠ、ClaⅠ、HinfⅠ酶切位點(diǎn)多態(tài)性密切相關(guān)。
　　 2.LDL-R基因的第2、4外顯子的XspⅠ、第8、12外顯子的ClaⅠ、第10B、14外顯子的HinfⅠ酶切位點(diǎn)多態(tài)性與高膽固醇血癥密切相關(guān)。
　　 3.LDL-R基因的第9外顯子的HinfⅠ酶切位點(diǎn)多態(tài)性與高膽固醇血癥未見獨(dú)立相關(guān)關(guān)系。
　　 第二部分 CETP基因TaqⅠ B多態(tài)性、D442G突變與高膽固醇血癥的相關(guān)性研究
　　

10、 目的：應(yīng)用PCR-RFLP對中國漢族人群CEIP TaqⅠ B多態(tài)性、D442G突變在對照組與不同程度高膽固醇血癥組的等位基因頻率和基因型頻率進(jìn)行了計(jì)算，同時測定兩種多態(tài)不同基因型的血漿CETP濃度、血脂水平，分析CETP TaqⅠ B多態(tài)性、D442G突變對血漿膽固醇水平的影響，并探討其相關(guān)關(guān)系。
　　 方法：730例膽固醇異?；颊呔鶃碜晕以后w檢中心查體者，按照2007年“中國成人血脂異常防治指南”中臨床分型標(biāo)準(zhǔn)，分為兩組。

11、其中包括：（1）高膽固醇血癥組446例；（2）邊緣高膽固醇血癥組284例。同時收集正常健康體檢者187例作為對照組。性別、年齡均匹配。檢測方法及統(tǒng)計(jì)方法同第一部分。
　　 小結(jié)：
　　 1.高膽固醇血癥組和邊緣高膽固醇血癥組血清CETP和LDL-c水平明顯高于對照組，血清HDL-c水平明顯低于對照組。
　　 2.CETP基因TaqIB多態(tài)性與高膽固醇血癥密切相關(guān)，B1等位基因攜帶者血清膽固醇水平明顯高于B2等位基

12、因攜帶者。
　　 3.CETP基因D442G突變與高膽固醇血癥有相關(guān)性，該突變是高膽固醇血癥的主要危險(xiǎn)因素之一。
　　 第三部分高膽固醇血癥患者PCSK9基因測序結(jié)果分析
　　 目的：為了尋找PCSK9基因與高膽固醇血癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的進(jìn)一步證據(jù)，本部分采用直接測序的方法對100例高膽固醇血癥患者的PCSK9基因12個外顯子進(jìn)行篩查，以期發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，揭示PCSK9基因的突變位點(diǎn)與高膽固醇血癥發(fā)生之間的相互關(guān)系

13、。
　　 方法：100例高膽固醇血癥患者均來自該院體檢中心查體者。血脂水平符合2007年“中國成人血脂異常防治指南”中高膽固醇血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時收集正常體檢者50人作為對照組，性別、年齡均匹配，血脂異常均為初次診斷，檢測血清空腹TC、TG、HDL-c、LDL-c、VLDL-c水平；取4mlEDTA-K2抗凝血，提取基因組DNA，引物設(shè)計(jì)采用生物學(xué)軟件Primer5.0，并與GenBank進(jìn)行比對。采用PCR方法擴(kuò)增目的基因片段

14、，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNAMAN軟件與GenBank公布的PCSK9基因序列進(jìn)行比對，找出突變位點(diǎn)。
　　 小結(jié)：
　　 1.PCSK9基因錯義突變D320N，V312F，R319E，框移突變934delGV312S，同義突變A305A、Q342Q、K125K，第2內(nèi)含子5'剪接位點(diǎn)突變與高膽固醇血癥有關(guān)。
　　 2.錯義突變R93C與低膽固醇血癥有關(guān)。
　　 綜合上述三部分內(nèi)容，本研究得出

15、如下結(jié)論：
　　 1.PCR-RFLP可以準(zhǔn)確的分析LDL-R和CEIP基因多態(tài)性，方法簡便快捷，適合于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
　　 2.TC、LDL、HDL水平與LDL-R基因XspⅠ、ClaⅠ、HinfⅠ酶切位點(diǎn)多態(tài)性密切相關(guān)；LDL-R基因的第2、4外顯子的XspⅠ、第8、12外顯子的ClaⅠ、第10B、14外顯子的HinfⅠ酶切位點(diǎn)多態(tài)性與高膽固醇血癥密切相關(guān)；第9外顯子的HinfⅠ酶切位點(diǎn)多態(tài)性與

16、高膽固醇血癥未見獨(dú)立相關(guān)關(guān)系。
　　 3.CETP基因TaqIB多態(tài)性與高膽固醇血癥密切相關(guān)，B1等位基因攜帶者血清膽固醇水平明顯高于B2等位基因攜帶者。D442G突變與高膽固醇血癥有相關(guān)性，該突變是高膽固醇血癥的主要危險(xiǎn)因素之一。
　　 4.PCSK9基因的錯義突變D320N，V312F，R319E，框移突變934delGV312S，同義突變A305A、Q342Q、K125K，第2內(nèi)含子5'剪接位點(diǎn)突變與高膽固醇血癥有