重慶市結(jié)核病耐藥的流行病學(xué)調(diào)查及耐藥相關(guān)基因分子特征研究.pdf

1、耐藥結(jié)核病尤其耐多藥結(jié)核病(Multi- drug resistance tuberculosis，MDR-TB)的發(fā)生和流行是自20世紀(jì)80年代中后期以來結(jié)核病疫情回升的主要原因之一。預(yù)防和控制耐(多)藥結(jié)核病已經(jīng)成為當(dāng)前結(jié)核病控制的主要任務(wù)，而了解結(jié)核病耐藥疫情基線數(shù)據(jù)和流行病學(xué)特征是制定預(yù)防和控制耐藥結(jié)核病的重要依據(jù)。世界衛(wèi)生組織和國際防癆和肺病聯(lián)合會(huì)(WHO/IUATLD)為了解全球耐藥結(jié)核病總的分布情況，于1994年啟動(dòng)全球結(jié)

2、核病耐藥性監(jiān)測計(jì)劃，在1994—2002年間，對(duì)全球114個(gè)國家和地區(qū)進(jìn)行了抗結(jié)核一線藥物(鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇)的耐藥性的調(diào)查，覆蓋全球約50％的人口，其調(diào)查結(jié)果顯示全球耐(多)藥結(jié)核病呈不斷蔓延擴(kuò)散的趨勢，發(fā)展中國家和地區(qū)上升尤為顯著。我國屬于耐藥程度較高的國家之一，被WHO列為“特別引起警示的國家和地區(qū)”和MDR-TB的“熱點(diǎn)”地區(qū)之一。 流行病學(xué)調(diào)查顯示：通常經(jīng)濟(jì)和衛(wèi)生、醫(yī)療條件等較差的地區(qū)，耐藥結(jié)核病疫情尤

3、為嚴(yán)重，同時(shí)結(jié)核病疫情和耐藥結(jié)核病的流行病學(xué)特征存在明顯的地區(qū)差異。重慶地處西南，農(nóng)村人口多，經(jīng)濟(jì)不夠發(fā)達(dá)，近10年尚無大樣本量的耐(多)藥結(jié)核病相關(guān)流行病學(xué)研究調(diào)查報(bào)道，因此了解本市耐(多)藥結(jié)核病的相關(guān)基線資料和流行病學(xué)特征對(duì)于促進(jìn)耐(多)藥結(jié)核病的控制有重要意義。本研究第一部分，即是對(duì)在2003年—2006年在重慶市法定結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)(結(jié)核病防治所和胸科醫(yī)院)連續(xù)收集的痰培養(yǎng)陽性的1089例結(jié)核病病例的耐藥情況和流行病學(xué)特征進(jìn)行分

4、析。 異煙肼(Isoniazide，INH)和乙胺丁醇(ethambutol，EMB)是WHO推薦使用的一線抗結(jié)核組合藥物之一。近年WHO/IUATLD在全球的結(jié)核病耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示：全球INH平均耐藥率為5.6％，大多數(shù)國家和地區(qū)INH耐藥率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，且在四種一線抗結(jié)核藥物(INH，RFP，SM和EMB)中，INH耐藥率在各國和地區(qū)均排列第一或第二位，我國INH耐藥率為17.6％，耐藥水平較高。全球平均EMB耐藥率為0

5、.8％(0～24.8)，盡管總體耐藥水平較低，但呈逐年快速上升趨勢，我國EMB耐藥率(1.5％)顯著高于全球平均EMB耐藥水平。INH和EMB耐藥率的高企和升高，將明顯影響WHO推薦的以此為主要組合藥物方案治療結(jié)核病的療效。從降低耐藥結(jié)核病病人死亡、減少傳染源、縮短傳染期的角度來看，早期診斷、早期選擇敏感藥物治療耐藥結(jié)核病病例是預(yù)防和控制耐(多)藥結(jié)核病和減少衛(wèi)生資源浪費(fèi)的重要措施之一。但目前以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的藥敏檢測方法需要較長的時(shí)間(1

6、～3月)才能得到結(jié)果，難以實(shí)現(xiàn)早期診斷和及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥的目的。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌INH耐藥和EMB耐藥的分子機(jī)制得到一定程度的闡明，目前研究已經(jīng)證實(shí)結(jié)核分枝桿菌內(nèi)編碼活化INH所必需的過氧化氫酶一過氧化物的katG基因(尤其katG315)的變異是INH耐藥性產(chǎn)生的最主要分子機(jī)制，但katG315在不同地區(qū)的INH耐藥結(jié)核分枝桿菌中的變異率存在明顯差異，從26％至95％不等。結(jié)核分枝桿菌中編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶

7、的embB基因突變(尤其306位密碼子)是引起結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥的最主要原因，embB306突變覆蓋約500/o—70qo的EMB耐藥菌株，是目前與EMB耐藥最相關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)記物。部分地區(qū)已將katG315和embB306突變作為耐藥分子標(biāo)記物，采用PCR-FRLP和PCR-SSCP等方法進(jìn)行臨床INH和EMB耐藥菌株的檢測，實(shí)現(xiàn)了INH和EMB耐藥病例的早期診斷和及時(shí)指導(dǎo)臨床治療，具有較高的特異性和敏感性，研究證明katG3

8、15、embB306分別在INH、EMB耐藥結(jié)核桿菌中突變率較高的地區(qū)，這些快速、價(jià)廉的分子生物學(xué)方法在臨床上應(yīng)用是可行的。 由于分子生物學(xué)檢測方法是通過基因型來推測細(xì)菌耐藥的表型，且katG基因和embB基因變異具有明顯的地域分布特點(diǎn)，重慶地區(qū)尚無這兩個(gè)基因在結(jié)核分枝桿菌中的突變譜、突變率的研究報(bào)道，katG315和embB306是否是本地區(qū)INH耐藥、EMB耐藥結(jié)核分枝桿菌的主要分子機(jī)制？是否可分別用于篩選或檢測INH耐藥、

9、EMB耐藥結(jié)核病的分子標(biāo)記物？有待研究闡明。本研究第二部分和第三部分采用測序方法分別對(duì)重慶不同耐藥組合的97株結(jié)核分枝桿菌中的katG基因和I01株結(jié)核分枝桿菌中的embB基因的多態(tài)性及它們與耐藥相關(guān)性進(jìn)行了分析，將有助于闡明以上問題。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 一、第一部分重慶市2003～2006年結(jié)核病耐藥情況的流行病學(xué)調(diào)查 1.重慶市結(jié)核病總耐藥率和耐多藥率分別是27.6％(301/1089)和7,3％(79/

10、1089)；其中初治耐藥率和耐多藥率分別是22.7％、4.1％，復(fù)治耐藥率和耐多藥率分別是56.2％、26.5％。整體耐藥水平與國內(nèi)外監(jiān)測結(jié)果比較，處于中等水平。 2.SM、INH、RFP、EMB耐藥率分別是16.3％、14.0％、10.7％和4.7％；近3年RFP、EMB耐藥率和耐多藥率呈逐年上升趨勢。 3.耐(多)藥病例分布無明顯性別和年齡特征，但與用藥史、經(jīng)濟(jì)條件差(居住鄉(xiāng)村、可支配年收入低于平均水平)存在較強(qiáng)聯(lián)系

11、。提示耐(多)藥結(jié)核病防治應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)直接面視下督導(dǎo)短程化療( Directly Observed Treatment Short course，DOTS)方案的實(shí)施和經(jīng)濟(jì)條件較差的結(jié)核病病例的規(guī)律全程治療。 4.耐藥病例的分布特征提示：重慶地區(qū)可能存在一定范圍、一定程度的耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播，應(yīng)加強(qiáng)結(jié)核病的耐藥監(jiān)測尤其分子水平的監(jiān)測，有利于早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防耐藥結(jié)核分枝桿菌大規(guī)模的擴(kuò)散，對(duì)于控制耐(多)藥結(jié)核病疫情有重要意義。

12、 二、第二部分重慶市97株結(jié)核分枝桿菌的katG315突變特征及其與異煙肼耐藥相關(guān)性的研究 1.重慶地區(qū)INH耐藥結(jié)核分枝桿菌中katG315突變譜包括S315T、S315N和S315三種類型，總突變率為75.5％(37/49)，其中81.1％(30/37)為S315T突變型，INH敏感菌株中未見katG315突變。katG315突變是本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌INH耐藥的主要分子機(jī)制。 2.以katG315突變做為診斷IN

13、H耐藥菌株的標(biāo)記物，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)比較，靈敏度為75.5％，特異度為100％，準(zhǔn)確度為87.6％(85/97)，其他各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)均提示：在本地區(qū)，該指標(biāo)用于INH耐藥菌株的快速診斷具有較好的的臨床應(yīng)用價(jià)值。 3.katG315在高度耐藥(1ug/ml)和耐多藥菌株中的突變率分布分別顯著高于低度耐藥(0.2 ug/ml)和單耐INH菌株，且與耐藥數(shù)量有關(guān)，一定程度上表明katG315突變與耐藥程度有關(guān)。 4.katG突變率

14、分析顯示：katG315變異是本地區(qū)INH耐藥產(chǎn)生的主要分子機(jī)制，24.5％的INH耐藥株未見katG315變異，表明在本地區(qū)還存在其他INH耐藥的分子機(jī)制，對(duì)于本地區(qū)結(jié)核病、耐藥結(jié)核病的防治有一定參考價(jià)值。 三、第三部分重慶101株結(jié)核分枝桿菌的embB306突變特征及其與乙胺丁醇耐藥相關(guān)性的研究 1.embB306在EMB耐藥菌株中突變率有明顯地域差異，重慶地區(qū)EMB耐藥菌株中embB306突變率66.7％，34/5

15、1顯著高于EMB敏感菌株的突變率(6.0％，3/50)(P(0.01)，與傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)比較，embB306突變作為EMB耐藥標(biāo)記物檢測EMB耐藥的靈敏度為66.70％(34/51)，特異度為90％(45/50)，準(zhǔn)確度為78.2％(79/101)。提示在沒有更好標(biāo)記物情況下，embB306突變應(yīng)用于本地區(qū)的EMB耐藥菌株的檢測有一定臨床意義。 2.embB306在EMB耐藥MDR菌株中突變率為84.0％(21/25)顯著高于非M

16、DR菌株中的突變率(50.0％，13/26)，且突變率隨耐藥數(shù)量增加而增加，提示embB306突變與耐藥程度有關(guān)。 3.embB突變譜較廣泛，embB306突變覆蓋66.7％(34/51)的EMB耐藥菌株，提示embB306突變是本地區(qū)EMB耐藥產(chǎn)生的主要分子機(jī)制，其他分子機(jī)制可能與大量稀少突變及其聯(lián)合作用有關(guān)。 總之，通過本研究獲得了重慶結(jié)核病耐藥基線資料和耐藥結(jié)核病的主要流行病學(xué)特征；同時(shí)明確了KatG315和emb