Desert Hedgehog誘導(dǎo)大鼠胚胎中腦神經(jīng)前體細胞定向分化的研究.pdf

1、神經(jīng)前體細胞（NPCs）是具有自我更新和多向分化能力的原始神經(jīng)細胞，其多向分化能力即在特定因素誘導(dǎo)下能向神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞分化。將NPCs用于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如帕金森?。≒D）的細胞移植治療具有應(yīng)用前景。對此目前有三種策略：（1）注射神經(jīng)營養(yǎng)因子或生長因子誘導(dǎo)腦內(nèi)NPCs向損傷部位遷徙、分化。（2）將原代培養(yǎng)或永生化的NPCs移植到相應(yīng)腦區(qū)，在體內(nèi)相應(yīng)微環(huán)境作用下分化為具有特定功能的神經(jīng)元。然而，這種植入的NPCs很少能夠定向分化為多巴

2、胺（DA）能神經(jīng)元，大多數(shù)移植細胞分化為膠質(zhì)細胞。（3）將原代培養(yǎng)或永生化神經(jīng)干細胞體外誘導(dǎo)分化為特定的DA能神經(jīng)元，然后移植到相應(yīng)腦區(qū)發(fā)揮治療效果。已有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)移植誘導(dǎo)分化DA能神經(jīng)元的PD模型大鼠行為有顯著改善。
　　 實驗證實，將來自睪丸的Sertoli細胞與其它組織來源細胞共培養(yǎng)可以影響這些細胞的生長、發(fā)育和分化。但Sertoli細胞表達的特定因子尤其是DHH的誘導(dǎo)作用還未見報道。為此，本博士學位論文擬以Sertol

3、i細胞表達的DHH因為切入點，深入探討Sertoli細胞是否能促進神經(jīng)前體細胞分化的可能性。
　　 本博士學位論文涉及的研究內(nèi)容主要包括三部分：
　　 第一部分：Sertoli細胞對大鼠胚胎中腦NPCs的營養(yǎng)及促分化作用
　　 目的：研究Sertoli細胞對胚胎中腦NPCs的營養(yǎng)及向DA能神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)作用。
　　 方法：將大鼠Sertoli細胞與胚胎13.5天大鼠中腦NPCs體外接觸共培養(yǎng)和非接觸共培

4、養(yǎng)10天，免疫熒光檢測DA能神經(jīng)元標記物酪氨酸羥化酶（TH）的表達情況。
　　 結(jié)果：接觸共培養(yǎng)和非接觸共培養(yǎng)10天時TH陽性的神經(jīng)元分別為30.56±7.08，26.45±6.23。而對照NPCs單獨培養(yǎng)組僅為1.12±0.06。
　　 結(jié)論：Sertoli細胞能夠促進與其共培養(yǎng)的胚胎中腦NPCs定向分化為DA能神經(jīng)元。
　　 第二部分：大鼠DHH基因克隆及其在條件細胞COS7、NIH/3T3、9L、星形膠質(zhì)細

5、胞和Sertoli細胞及上清中的表達與過表達
　　 目的：從SD大鼠睪丸組織中克隆DHH基因，構(gòu)建真核表達載體pLXSN/DHH：感染條件細胞COS7、NIH/3T3、9L、星形膠質(zhì)細胞和Sertoli細胞，用免疫熒光細胞化學、實-時定量PCR、Western Blot等方法鑒定DHH在上述細胞及上清中的表達與過表達。
　　 方法：
　　 1.DHHcDNA的克?。喝〈笫蟛G丸組織，Trizol一步法提取總RNA。

6、甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳證實所提RNA沒有明顯降解后，SuperscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶作用下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用T4DAN連接酶將其連于pGEM T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)菌，挑取白色菌落篩選重組質(zhì)粒，酶切鑒定后送大連寶生物有限公司測序。
　　 2.DHH真核表達載體的構(gòu)建：分別提取質(zhì)粒pGEM T Easy/DHH、pLXSN、用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，電泳分離，玻璃奶純化回收DHH片段和線性質(zhì)粒pL

7、XSN，T4DAN連接酶連接兩片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α，小量提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ酶切鑒定后大量提取。
　　 3.脂質(zhì)體LipofectamineTM轉(zhuǎn)染PT67細胞及DHH在條件細胞中的表達：當PT67細胞融合度達到70～80％時，將真核表達載體pLXSN/DHH-LipofectamineTM復(fù)合物加入其中，經(jīng)G418篩選。免疫細胞化學的方法證實外源基因在包裝細胞系中的表達。待細胞增殖后傳代，培養(yǎng)3

8、6～40h后收集上清并感染條件細胞COS7、NIH/3T3、9L、星形膠質(zhì)細胞和Sertoli細胞，G418篩選單克隆擴增培養(yǎng)。用免疫熒光、實-時定量PCR、Western Blot等方法鑒定DHH在上述細胞中的表達并能分泌到培養(yǎng)上清中。
　　 結(jié)果：
　　 1.DHHcDNA的克隆及真核表達載體的構(gòu)建：所提RNA通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA的帶型估計mRNA的完整性。清楚看到28S、18S和5SRNA帶型。用R

9、T-PCR擴增得到預(yù)期的cDNA片段，其大小為1220bp。PCR產(chǎn)物加尾后克隆于pGEMT-Easy載體，用EcoRⅠ和BamHⅠ進行初步酶切鑒定，有1220bp片段插入的克隆繼續(xù)以載體上的酶和片斷內(nèi)部的酶進行酶切、測序，結(jié)果證實插入片段為DHHcDNA，其序列與GenBank（XM_343327）報道的一致?；厥諟y序正確質(zhì)粒pGEM T Easy/DHH的插入片段，與經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切的線性pLXSN質(zhì)粒片段連接。轉(zhuǎn)化細菌

10、，小提質(zhì)粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，有1200bp左右的條帶，說明pLXSN/DHH載體構(gòu)建成功。
　　 2.DHH在條件細胞及培養(yǎng)上清中的表達：免疫細胞化學的方法證實外源基因DHH能在PT67包裝細胞系中表達；所收集病毒上清感染條件細胞COS7、HIN/3T3、9L、星形膠質(zhì)細胞和Sertoli細胞，經(jīng)免疫熒光、實-時定量PCR、Western Blot等方法鑒定后均可見DHH在上述細胞中的高表達并能分泌到培養(yǎng)上中清。

11、
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了真核表達載體pLXSN/DHH。DHH能在條件細胞中高表達并可分泌到培養(yǎng)上清中，具有良好的生物活性。
　　 第三部分：對Desert Hedgehog（DHH）誘導(dǎo)大鼠胚胎中腦神經(jīng)前體細胞（NPCs）定向分化能力的探討
　　 目的研究Desert Hedgehog（DHH）對胚胎中腦神經(jīng)前體細胞（NPCs）向多巴胺能神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)作用
　　 方法：將實驗分為四大組：（一）成功表達

12、DHH的條件細胞COS7、NIH/3T3和9L分別與胚胎中腦神經(jīng)前體細胞（NPCs）接觸共培養(yǎng)和非接觸共培養(yǎng)；（二）正常紋狀體來源的星形膠質(zhì)細胞和成功表達DHH的星形膠質(zhì)細胞分別與胚胎中腦神經(jīng)前體細胞（NPCs）接觸共培養(yǎng)和非接觸共培養(yǎng)；（三）Sertoli細胞過表達DHH與阻斷DHH發(fā)揮作用，分別與胚胎中腦神經(jīng)前體細胞（NPCs）接觸共培養(yǎng)和非接觸共培養(yǎng)；（四）胚胎中腦神經(jīng)前體細胞（NPCs）單獨培養(yǎng)做為對照組。共培養(yǎng)10天后，免疫熒

13、光檢測DA能神經(jīng)元標記物TH的表達情況。
　　 結(jié)果：第一組在接觸共培養(yǎng)10天后偶見TH陽性細胞，但并無統(tǒng)計學意義；第二組正常星形膠質(zhì)細胞與NPCs接觸共培養(yǎng)和非接觸共培養(yǎng)10天TH陽性細胞分別為24.89±6.32，16.57±4.03；表達DHH的星形膠質(zhì)細胞與NPCs接觸共培養(yǎng)和非接觸共培養(yǎng)10天TH陽性細胞分別為25.39±6.01，14.72±2.90；第三組Sertoli細胞過表達DHH與NPCs接觸共培養(yǎng)和非接觸共

14、培養(yǎng)10天TH陽性細胞分別為30.56±7.08，26.45±6.23；而加抗DHH抗體的Sertoli與NPCs接觸共培養(yǎng)和非接觸共培養(yǎng)10天TH陽性細胞分別為31.36±7.42，26.07±6.12。第四組NPCs單獨培養(yǎng)10天TH陽性細胞為1.12±0.06。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建條件細胞COS7、NIH/3T3、9L、星形膠質(zhì)細胞與NPCs的接觸共培養(yǎng)和非接觸共培養(yǎng)體系；成功從Sertoli細胞過表達DHH與阻斷DHH