酵母雙雜交系統(tǒng)的建立及CLN8P互作蛋白的篩選與初步鑒定.pdf

1、目的：神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(neuronalceroidlipofuscinoses，NCLs)是一組人類進行性神經(jīng)元變性疾病，多為常染色體隱性遺傳?；咎卣鳛槿苊阁w內(nèi)蠟樣脂褐質(zhì)沉積。主要分為NCL1～NCL1010型，CLN8為NCL8的致病基因，其功能及其在發(fā)病機制中的作用尚不清楚。本研究首先建立酵母雙雜交系統(tǒng)，再應用該系統(tǒng)從人胎腦文庫中篩選CLN8P相互作用蛋白質(zhì)，并對候選蛋白進行初步鑒定分析。通過對相互作用蛋白質(zhì)的篩選及研究，

2、探討CLN8的功能，為NCL8和NCLs疾病群的發(fā)病機制研究提供線索，并為疾病的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡提供資料。　　方法：1)以SV40大T抗原和P53蛋白的相互作用為陽性對照建立酵母雙雜交系統(tǒng)；2)將CLN8編碼區(qū)序列克隆至MATCHMAKERLexA酵母雙雜交系統(tǒng)pLexA質(zhì)粒，構(gòu)建誘餌(bait)---pLexA-CLN8，再將pLexA-CLN8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母菌株EGY48(p8op-LacZ)，建立EGY48(p8op-LacZ)

3、-pLexA-CLN8融合菌株，檢測其毒性和自激活性；3)以pLexA-CLN8為誘餌質(zhì)粒，應用序列轉(zhuǎn)化法篩選人胎腦cDNA文庫，得到Leu+LacZ+陽性克隆，并用酶切鑒定其外源性片斷；4)應用共轉(zhuǎn)化法將獲得的陽性質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒一對一重新轉(zhuǎn)入酵母菌內(nèi)，對相互作用進行驗證；5)對驗證后的陽性克隆的外源性片斷進行測序及同源性分析?！　〗Y(jié)果：1)建立了酵母雙雜交檢測系統(tǒng)；2)構(gòu)建了酵母表達質(zhì)粒pLexA-CLN8及EGY48(p8op-L

4、acZ)-pLexA-CLN8融合菌株，并通過檢測證實CLN8P對酵母細胞無毒性、無自激活性；3)以構(gòu)建好的EGY48(p8op-LacZ)-pLexA-CLN8融合菌作“誘餌”，從人胎腦cDNA文庫中篩選得到60個Leu+LacZ+陽性克隆。提取質(zhì)粒擴增后酶切鑒定，獲得有外源性片斷的質(zhì)粒45個；4)將獲得的具有外源性片段的文庫質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒一對一重新轉(zhuǎn)入酵母體內(nèi)，對相互作用進行驗證，共獲得陽性克隆22個；5)對驗證后陽性克隆測序并進行