組織因子在骨髓移植GVHD中的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、第一部分 TNFα協(xié)同CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)受體HUVEC細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：異基因造血干細(xì)胞移植時(shí)，循環(huán)血中損傷脫落的內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，且與移植相關(guān)的血管并發(fā)癥成正相關(guān)。移植的動(dòng)物模型中，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是發(fā)生于其它組織器官損傷之前的早期事件，而其發(fā)生的機(jī)制及誘導(dǎo)因素尚不明確，我們的研究目的是以細(xì)胞因子TNFα為誘導(dǎo)因素，觀察異基因CD8+T細(xì)胞導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的體外效應(yīng)。
　　 方法：采用密度梯度法分離

2、人周?chē)獑蝹€(gè)核細(xì)胞，用CD8+T細(xì)胞亞群陰性分選柱試劑盒分選出CD8+T細(xì)胞。將HUVEC細(xì)胞株分為4組，分別是1)1640對(duì)照組2)低劑量TNFα處理組3)無(wú)TNFα處理混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)組4)低劑量TNFα處理混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)組。用AnnexinV和PI雙標(biāo)后，熒光免疫顯微鏡及流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡分析.
　　 結(jié)果：低劑量5ng/mlTNFα不能引起HUVEC凋亡，與1640對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異p＞0.05。用同樣劑量的TNF

3、α預(yù)處理HUVEC后，與CD8+T細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示其24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的早期凋亡率高達(dá)83.6±0.42[％]，是非TNFα預(yù)混合培養(yǎng)組的5.8倍。組間比較存在非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異p＜0.001。
　　 結(jié)論：體外供體CD8+T淋巴細(xì)胞能夠引起受體血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。低劑量的TNFα的協(xié)同對(duì)凋亡起明顯的放大作用。
　　 第二部分 A20和Caspase3在異基因CD8+T細(xì)胞致HUVEC凋亡途徑中的表達(dá)及意

4、義
　　 目的：異基因造血干細(xì)胞移植時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡不僅是移植相關(guān)血栓并發(fā)癥的重要病理特征，而且可能在移植物抗宿主病的組織器官損傷中起早期介導(dǎo)作用。通過(guò)檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中A20蛋白及Caspase3的表達(dá)以明確凋亡發(fā)生的機(jī)制.
　　 方法：采用密度梯度法分離人周?chē)獑蝹€(gè)核細(xì)胞，用CD8+T細(xì)胞亞群陰性分選柱試劑盒分選出CD8+T細(xì)胞。HUVEC細(xì)胞株經(jīng)過(guò)低劑量TNFα處理后與CD8+T細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)。用

5、Annexin-V和PI雙標(biāo)后，流式細(xì)胞儀對(duì)HUVEC進(jìn)行凋亡分析，用全波長(zhǎng)熒光分光光度計(jì)測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白Caspase3的活性。用westen-blot方法檢測(cè)HUVEC中A20蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：異基因CD8+T在與HUVEC混合后可引起HUVEC凋亡，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示其24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的早期凋亡率最高，達(dá)83.6±0.42[％]。而晚期凋亡相關(guān)蛋白Caspase3活性在48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)達(dá)高峰，熒光強(qiáng)度為13.59±0.

6、27，此后顯著性降低，與對(duì)照組比較存在非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異p＜0.001。A20蛋白在異基因CD8+T細(xì)胞導(dǎo)致的HUVEC凋亡中,與其嚴(yán)重程度成負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：體外供體CD8+T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致受體血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡途徑中Caspase3的激活介導(dǎo)了HUVEC凋亡的發(fā)生。信號(hào)蛋白A20可能對(duì)凋亡的發(fā)生起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　 第三部分組織因子胞內(nèi)段小干擾RNA載體的構(gòu)建及其對(duì)HUVEC凋亡的保護(hù)作用
　　 目的：構(gòu)建

7、組織因子胞內(nèi)段小干擾RNA載體，將其轉(zhuǎn)入HUVEC細(xì)胞株后，觀察混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，在基本不影響凝血功能的情況下，對(duì)HUVEC凋亡的保護(hù)作用。
　　 方法：體外設(shè)計(jì)特異性干擾組織因子胞內(nèi)段氨基酸序列合成的小干擾片斷，將其插入質(zhì)粒DNA后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中大量擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒后，用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)入HUVEC細(xì)胞株中，磁珠法檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，培養(yǎng)上清液的APTT時(shí)間,流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染空載對(duì)照組、siRNAI、siRNAII凋亡細(xì)胞百

8、分率。
　　 結(jié)果：與空載對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染了siRNAI質(zhì)粒的HUVEC的凋亡率顯著下降。轉(zhuǎn)染了siRNAII質(zhì)粒的HUVEC的凋亡率雖然不如siRNAI下降明顯，但與空載對(duì)照組比較，也有顯著性差異，P＜0.05。測(cè)定的培養(yǎng)上清中APTT時(shí)間，與空白對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性，P＞0.05。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建的組織因子胞內(nèi)段小干擾RNA質(zhì)粒，在不影響凝血功能的情況下，可對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡起保護(hù)作用。
　　 第四部分

9、 CD4+T誘導(dǎo)受體HUVEC組織因子表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　 目的：阻斷組織因子細(xì)胞內(nèi)段的蛋白的合成，在基本不影響凝血的情況下，可以對(duì)異基因T細(xì)胞所導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡起保護(hù)作用。而內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡介導(dǎo)了早期GVHD的發(fā)生，那么下調(diào)TF胞內(nèi)段的表達(dá)可能可以減輕GVHD的程度而不影響正常凝血。如果移植后發(fā)生GVHD的同時(shí)伴發(fā)血栓并發(fā)癥時(shí)，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)外段的TF的表達(dá)可以起抗凝血和減輕GVHD的雙重作用。而組織因子表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控

10、機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)異基因CD4+T誘導(dǎo)HUVEC組織因子表達(dá)時(shí)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的表達(dá)，為臨床尋找新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 方法：采用密度梯度法分離人周?chē)獑蝹€(gè)核細(xì)胞，用CD4+T細(xì)胞亞群陰性分選柱試劑盒分選出CD4+T細(xì)胞。HUVEC細(xì)胞株經(jīng)過(guò)γ干擾素預(yù)處理后與CD4+T細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVEC組織因子的表達(dá)，real-time-PCR檢測(cè)組織因子mRNA的轉(zhuǎn)錄狀況。Westen-blot檢

11、測(cè)信號(hào)分子JNK、P38-MAPK的表達(dá)及I-κα的磷酸化狀態(tài)。
　　 結(jié)果：異基因CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)HUVEC組織因子表達(dá)時(shí)，TF在混合反應(yīng)后12小時(shí)明顯增加，24小時(shí)達(dá)到高峰，持續(xù)至48小時(shí)后逐步降低到基礎(chǔ)水平。而組織因子的轉(zhuǎn)錄活性在6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到高峰，持續(xù)至48小時(shí)后逐步降低。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子JNK、P38-MAPK的蛋白和I-κα的磷酸化的蛋白在1小時(shí)內(nèi)均有表達(dá)，與對(duì)照組比較，均存在顯著性差異P＜0.05。