棉花基因槍轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、該研究采用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化技術(shù),將外源雙價(jià)抗蟲基因Bt+CpTI導(dǎo)入棉花莖尖分生組織,獲得了轉(zhuǎn)基因植株;將GUS報(bào)告基因?qū)朊藁ㄅ咝杂鷤M織,獲得了卡那霉素抗性的胚狀體;并嘗試了基因槍和農(nóng)桿菌協(xié)同轉(zhuǎn)化法在棉花轉(zhuǎn)基因上的應(yīng)用.采用棉花莖尖分生組織為轟擊受體,優(yōu)化出了3日苗齡的莖尖進(jìn)行基因槍轟擊,并摸索出了一條適合莖尖再生的途徑.對轟擊參數(shù)進(jìn)行綜合比較,優(yōu)選出最佳轟擊組合.確定了適合基因槍莖尖轉(zhuǎn)化體系的梯度篩選法.結(jié)果表明,基因槍轟擊過程中,

2、采用轟擊壓力1100psi,真空度28inch Hg,轟擊距離9cm,轟擊1次,轉(zhuǎn)化效果最佳.卡那霉素抗性苗平均轉(zhuǎn)化率4.23﹪,轉(zhuǎn)化周期80天左右.后期對抗性苗進(jìn)行嫁接,成活率90﹪以上.對獲得的卡那霉素抗性植株進(jìn)行PCR檢測,證明外源基因已經(jīng)整合到棉花基因組中.采用棉花胚性愈傷組織為轟擊受體,通過GUS瞬間表達(dá),對胚性愈傷組織滲透處理的滲透劑種類、濃度、時(shí)間以及轟擊過程中轟擊距離、轟擊次數(shù)、DNA用量、真空度等進(jìn)行了優(yōu)化.并確定了適

3、合基因槍棉花胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系的篩選方法.結(jié)果表明,采用0.3mol/L的甘露醇在轟擊前4小時(shí),轟擊后16小時(shí)進(jìn)行滲透處理,轟擊距離9cm,轟擊次數(shù)2次,DNA用量0.5-1.0 μg/槍,真空度28inch HgGUS表達(dá)效果最佳,恢復(fù)培養(yǎng)后采用150mg/L卡那霉素進(jìn)行直接篩選,獲得抗性胚狀體.2個(gè)月后,對卡那霉素抗性的胚性愈傷組織進(jìn)行GUS基因的穩(wěn)定表達(dá)分析,初步證明GUS基因已轉(zhuǎn)入棉花基因組中.同時(shí)對基因槍和農(nóng)桿菌協(xié)同轉(zhuǎn)化棉花