水稻黑條矮縮病毒玉米分離物的分子特性及其侵染體系.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)在日本侵染水稻引起水稻黑條矮縮病,玉米粗縮病毒(Maize roughdwarfvirus,MRDV)在歐洲侵染玉米引起玉米粗縮病,研究表明兩者在寄主范圍和基因組S1,S4,S5和S6存在差異.為比較RBSDV玉米粗縮病分離物全基因組水平上的變異和分子進(jìn)化,以湖北玉米粗縮病病毒分離物(RBSDV-Hbm)為材料,提取病毒dsRNA,克隆并測(cè)定了

2、基因組S1,S4,S5和S6的全序列.其中S1全長(zhǎng)4501bp,編碼約168kDa的蛋白,結(jié)構(gòu)分析它含有依賴RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)特征性的GDD(Glycine-Aspartate-Aspartate)結(jié)構(gòu)域和其它保守的區(qū)域.以RdRp的氨基酸序列為基礎(chǔ)建立了相關(guān)呼腸孤病毒的進(jìn)化關(guān)系.RBSDV-Hbm S4(AY160687)全長(zhǎng)3617bp,含有一個(gè)閱讀框,編碼約1

3、35 kDa的蛋白,同源性比較可以推測(cè)該蛋白可能是病毒的B突起(B-spike)結(jié)構(gòu)蛋白:S5全長(zhǎng)3164bp,除一個(gè)大的閱讀框(ORF1)外,還可能有一個(gè)部分重疊的小閱讀框(ORF2),并且ORF2起始位置與RBSDV浙江水稻分離物(RBSDV-Zjr)不同;S6全長(zhǎng)2645bp,編碼約90 kDa的蛋白,其與SMC和MAD蛋白有相同的保守域.構(gòu)建了RBSDV外殼蛋白P10的原核表達(dá)載體pGEX-P10,IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌種表達(dá)

4、.表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Glutathione Sepharose 4B純化后免疫家兔制備抗血清,分別建立了ELISA和Western blotting檢測(cè)方法,成功地從病葉和灰飛虱體內(nèi)檢測(cè)到病毒,其中ELISA可以從健葉稀釋液中檢測(cè)到160 ng的P10,病葉稀釋到1/1280也可以與健康材料區(qū)分開(kāi).用粗提純的RBSDV病毒侵染水稻原生質(zhì)體和小麥質(zhì)壁分離的懸浮細(xì)胞.兩天后用主要外殼蛋白P10和病毒非結(jié)構(gòu)蛋白P6抗血清Western blottin

5、g檢測(cè),結(jié)果都呈陽(yáng)性.用P10抗血清也證明了病毒粗提液能夠直接侵染小麥懸浮細(xì)胞和愈傷.為驗(yàn)證提取的病毒基因組的侵染活性,分別設(shè)三種處理,即:ssRNA、dsRNA和ssRNA/dsRNA mix,脂質(zhì)體包被后電擊轉(zhuǎn)染水稻原生質(zhì)體,P8抗血清Western blotting檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性,表明病毒RNA在細(xì)胞內(nèi)翻譯產(chǎn)生了相應(yīng)的蛋白.Northern blotting檢測(cè)dsRNA和ssRNA/dsRNA mix轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)果呈陽(yáng)性,ssR