抗稻瘟病基因pi-d2導(dǎo)入水稻提高稻瘟病抗性和一份條斑和穎花異常水稻突變體研究.pdf

1、Ⅰ抗稻瘟病基因pi-d2導(dǎo)入水稻提高稻瘟病抗性的研究 水稻稻瘟病是水稻生產(chǎn)中的最嚴(yán)重病害之一，俗稱(chēng)水稻“癌癥”?？刂频疚敛『Φ姆椒ㄖ饕鞘褂脷⒕鷦┖屠每共∑贩N。植物基因工程的興起為病害的控制提供了更廣泛的選擇余地。利用該技術(shù)可向現(xiàn)有栽培品種中導(dǎo)入外源抗病基因而不受種屬限制，拓展了可利用基因的來(lái)源，這無(wú)疑為作物抗病育種工作開(kāi)辟了一條嶄新而有效的途徑和發(fā)展空間。在水稻中已克隆了六個(gè)抗病R基因Pi-b、Pi-ta、Pi-9、Pi-2

2、、Piz-t和Pi-d2。前5個(gè)基因蛋白屬NBS-LRR類(lèi)蛋白，而Pi-d2具有一個(gè)獨(dú)特的B-lectin而作為新的一類(lèi)抗病蛋白。本研究首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Pi-d2基因轉(zhuǎn)入水稻感病品種麗江新團(tuán)黑谷、日本晴和抗病品種中花9號(hào)等，進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)、GUS活性檢測(cè)和抗病性鑒定，得到了對(duì)稻瘟病抗性提高的水稻材料，為水稻以及其它禾本科植物抗病分子育種奠定基礎(chǔ)，并為有性雜交育種提供了基因資源。主要研究結(jié)果如下： 1.以不同水稻品種的幼

3、胚和成熟胚作為外植體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的基因三種不同的表達(dá)載體(含有長(zhǎng)為3.2kb自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Pi-d2基因組序列的pCB6.3k、含有長(zhǎng)為2.2kb自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Pi-d2基因組序列的pCB5.3k和35S驅(qū)動(dòng)的.Pi-d2基因全長(zhǎng)cDNA序列的表達(dá)載體pZH01-2.72kb以及陰性對(duì)照載體pZH01-tp309)導(dǎo)入到水稻中，獲得一批轉(zhuǎn)Pi-d2基因的潮霉素抗性植株。 2.在農(nóng)桿菌介導(dǎo)過(guò)程中首次將PSK添加在共培

4、養(yǎng)基中提高了轉(zhuǎn)化效率。PSK濃度為10nmol/L時(shí)，抗性愈傷出愈率比對(duì)照提高最高達(dá)11％；當(dāng)PSK為200noml/L時(shí)，幾乎完全抑制抗性愈傷的生長(zhǎng)。PSK還與篩選培養(yǎng)基中的2,4-D濃度有關(guān)，2,4-D為2mg/L比1mg/L更有利抗性愈傷生長(zhǎng)。 3.PCR、RT-PCR、Southern blot雜交等分子檢測(cè)結(jié)果證明外源基因以1-4個(gè)拷貝隨機(jī)插入水稻基因組中，并在轉(zhuǎn)基因植株中穩(wěn)定遺傳。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株后代的潮霉素抗性分析表明

5、轉(zhuǎn)基因的整合情況大多為單位點(diǎn)、單拷貝。潮霉素的抗性已穩(wěn)定傳至T<,2>代，獲得轉(zhuǎn)基因純合株系。 4.對(duì)35個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系的T<,1>代植株接種結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株對(duì)稻瘟病生理小種ZB15的抗性提高，病斑大小和數(shù)量減少，抗性呈孟德?tīng)柡头敲系聽(tīng)柗蛛x。目的基因三種表達(dá)載體在受體中所表現(xiàn)的對(duì)ZBl5抗性無(wú)明顯差異。T<,2>代潮霉素抗性植株接種結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系仍然對(duì)稻瘟病ZBl5具有抗性，3個(gè)株系內(nèi)存在抗感分離，且T<,1>代抗性較好

6、的株系在T2代對(duì)稻瘟病仍具有較好的抗性，T<,1>和T<,2>代植株抗稻瘟病性結(jié)果較為一致。 5.連續(xù)三年的田間試驗(yàn)表明轉(zhuǎn)基因植株抗穗頸瘟的能力大部分增強(qiáng)；抗葉瘟的轉(zhuǎn)基因株系不一定抗頸瘟。通過(guò)田間試驗(yàn)，篩選到高抗稻瘟病株系。 6.用39個(gè)稻瘟病菌株測(cè)定轉(zhuǎn)Pi-d2基因9個(gè)高代材料的抗譜表明不同轉(zhuǎn)基因株系的抗病頻率不同，目的基因在感病植株中的表達(dá)抗病頻率提高十分明顯，最高提高達(dá)91.7％。而在抗性品種中花9號(hào)中抗病頻率基本

7、未提高。用中國(guó)農(nóng)科院收集的58個(gè)菌株對(duì)四個(gè)轉(zhuǎn)基因早代純合株系的抗譜測(cè)定表明轉(zhuǎn)基因品系對(duì)81.48％以上菌株表現(xiàn)抗性，具有廣譜抗性特點(diǎn)。 7.通過(guò)對(duì)目的基因不同三個(gè)表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)分析，表明Pi-d2基因長(zhǎng)為2.2kb或3.2kb自身啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植株中具有啟動(dòng)子功能。具有Pi-d2基因基因組序列的轉(zhuǎn)基因植株與具有cDNA序列轉(zhuǎn)基因植株對(duì)稻瘟病的抗性都有提高。 8.對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)藝性狀考查結(jié)果表明除少部分農(nóng)藝性狀發(fā)

8、生變化外，大部分轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀沒(méi)發(fā)生顯著變化。對(duì)隨機(jī)抽取的一份轉(zhuǎn)基因進(jìn)行的稻米營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因稻米中的營(yíng)養(yǎng)成分未發(fā)生明顯改變。 Ⅱ一份條斑和穎花異常水稻突變體研究 水稻是單子葉植物的模式植物。對(duì)水稻的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)在水稻遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一個(gè)不含外源基因的條斑和穎花異常的突變體，并對(duì)突變體進(jìn)行了形態(tài)和組織學(xué)鑒定及遺傳分析，為突變基因的克隆打下基礎(chǔ)。其研究結(jié)果如下：

9、 1.突變體表型特征：該突變體的莖、葉、穗出現(xiàn)條斑。在分蘗盛期，一些葉片始分岔或卷曲；花器官數(shù)目增多，表現(xiàn)為多內(nèi)外稃，葉片狀漿片，或漿片增大，雌蕊增多，穎花開(kāi)裂。極端表型為同一穎花中長(zhǎng)出幾朵小花或小花枝梗伸長(zhǎng)為花序。 2.生理特征：葉綠素總含量和凈光合速率明顯低于野生型。在分蘗中期、開(kāi)花前期和開(kāi)花后期三個(gè)時(shí)期，SOD、POD、CAT與性狀表達(dá)呈一定的關(guān)系。 3.細(xì)胞學(xué)特性：透射電鏡對(duì)葉片白色組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)

10、細(xì)胞壁內(nèi)陷，質(zhì)體結(jié)構(gòu)異常，不能發(fā)育出正常葉綠體所具有的片層和類(lèi)囊體。過(guò)渡區(qū)的緊靠綠色部分的細(xì)胞較大，葉綠體發(fā)育相對(duì)正常，而靠近白色區(qū)的細(xì)胞很小，葉綠體的基粒排列紊亂。突變體綠色組織部分中的細(xì)胞生長(zhǎng)正常。利用掃描電鏡對(duì)花器官形態(tài)發(fā)生過(guò)程進(jìn)行觀(guān)察，內(nèi)外稃原基正常形成，其后突變體表現(xiàn)出與野生型穎花原基發(fā)育明顯不同的特征。突變體開(kāi)始形成額外的內(nèi)/外稃原基。穎花原基出現(xiàn)不均等分裂，一般為二裂原基，較大部分分化較早，甚至有些穎花原基出現(xiàn)三個(gè)不等分裂

11、。在雄蕊原基和內(nèi)外稃之間，有膨大的漿片原基出現(xiàn)，后發(fā)育成類(lèi)稃狀漿片。雄蕊原基發(fā)育不同步，原基大小也不一樣；花分生組織的較野生型大，并且一些具有永久的活性。 4.組織學(xué)特性：石蠟切片觀(guān)察生長(zhǎng)扭曲的葉片發(fā)現(xiàn)有維管束鞘細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，或一些泡狀細(xì)胞增大。 5.遺傳學(xué)特性：通過(guò)突變體與4個(gè)葉色正常的材料雜交和回交遺傳分析，突變性狀呈細(xì)胞質(zhì)遺傳方式。提取水稻葉綠體基因組DNA，并用180個(gè)RAPD引物PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出1100個(gè)