豬Ⅱ型圓環(huán)病毒分離鑒定及嵌合病毒PCV2-1感染性克隆構(gòu)建的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(PorcineCircovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)，其基因組為單股環(huán)狀DNA，病毒粒子無囊膜，呈二十面體對稱，是目前已知的最小病毒之一。PCV有Ⅰ型(PCV1)和Ⅱ型(PCV2)兩種基因型，PCV1首先由Tischer于PK-15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，基因組全長1759bp，無致病變性；PCV2基因組長1767bp或1768bp，被認(rèn)為是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PostweaningMultisy

2、stemicWastingSyndrome，PMWS)的主要病原。 本研究通過PCR擴(kuò)增，從河南某豬場送檢的疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病豬腹股溝淋巴結(jié)中檢測到了豬Ⅱ型圓環(huán)病毒(PorcineCircovirusType2，PCV2)核酸，將病料研磨、過濾除菌后接種無PCV1和PCV2污染的PK-15細(xì)胞，盲傳12代后用PCR方法仍然能夠在接種細(xì)胞中檢測到PCV2核酸。從接毒細(xì)胞中收獲病毒經(jīng)超速離心純化，負(fù)染后電鏡觀察，可見直

3、徑約17nm，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)的病毒粒子，將該毒株命名為PCV2HeNan株(GenBank登陸號：AY969004)。序列分析表明：該株病毒全基因組長1767bp，包含11個開放讀碼框，與PCV1的核苷酸同源性介于76.2％-77.3％，與其他PCV2株的同源性介于95.5％-99.6％。根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬圓環(huán)病毒的核苷酸序列，設(shè)計3對特異性引物。通過PCR方法，以引物P1和P2從接毒細(xì)胞中擴(kuò)增到豬Ⅱ型圓環(huán)病毒全基因組，克

4、隆入pBluescriptⅡSK(+)載體構(gòu)建質(zhì)粒SK-PCV2，以其為模板用引物P5和P6擴(kuò)增其不包含PCV2-ORF2的部分基因(SK-PCV2△ORF2)；另一對引物P3、P4用于特異性擴(kuò)增豬Ⅱ型圓環(huán)病毒(PCV1)的ORF2基因，與前面得到的SK-PCV2△ORF2基因連接，構(gòu)建嵌合型質(zhì)粒SK-PCV2-1，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建雙聯(lián)體質(zhì)粒SK-PCV2-1(DB)。體外轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，盲傳四代后，用RT-PCR和間接免疫熒光方法檢