雞堆型艾美耳球蟲DNA疫苗的研究.pdf

1、近10多年來,雞球蟲病的免疫預(yù)防研究越來越受到人們的重視.尋找免疫原性好的保護性抗原,是完成基因工程苗和核酸疫苗研究的前提.微管是球蟲的一種重要的細胞器,在球蟲入侵宿主細胞的過程中起著重要作用,該論文以E.acervulina的微管蛋白為研究對象,進行了如下試驗:1.E.acervulina α-微管蛋白基因的克隆以E.acervulina BJ株孢子化卵囊總RNA為模板進行RT-PCR,按照Genebank上發(fā)表的α-微管蛋白基因的序

2、列(Yamage M,1995)設(shè)計引物,上、下游引物分別加上BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點,擴增的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接后轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞,藍白斑篩選,將PCR和酶切鑒定正確的陽性質(zhì)粒進行測序.結(jié)果表明,擴增產(chǎn)物大小為1955bp,與Yamage M(1995)在Genebank上登錄的α-微管蛋白基因的同源性為97.4﹪.此基因現(xiàn)已作為E.acervulina BJ株的α-微管蛋白基因登錄到Genebank上,

3、登錄號是AY488134.2.α-微管蛋白基因的表達及鑒定重新設(shè)計表達引物,以陽性質(zhì)粒為模板,克隆α-微管蛋白基因的閱讀框,與pGEX-6P-1載體連接后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)表達菌,用1.0mM IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳后發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)后2h蛋白表達量即達到較高的水平,5h達到高峰,表達蛋白的分子量為69kDa,波層掃描分析表達蛋白占菌體蛋白的33﹪.用GST抗體進行Western-blot檢測,成功檢測到特異性

4、條帶.3.α-微管蛋白真核表達載體(p-α-tubulin)的構(gòu)建將微管蛋白基因的ORF片段插入到真核表達載體pcDNA3.1中,構(gòu)建成核酸疫苗pcDNA3.1-α-tubulin(p-α-tubulin),經(jīng)酶切和PCR鑒定為正確插入.4.α-微管蛋白亞單位疫苗和核酸疫苗的免疫保護效果研究核酸疫苗和亞單位疫苗分別設(shè)高(100μg)、中(50μg)、低(25μg)三個劑量組,同時設(shè)地克珠利藥物組、活卵囊組、紅對照組和空白對照組,在雞只7