豬Ghrelin基因的克隆、表達(dá)及組織定位研究.pdf

1、Ghrelin是由28個氨基酸組成的第一個生長激素促分泌素受體的內(nèi)源性配體,最早是由Kojima等在小鼠和人的胃內(nèi)分泌細(xì)胞及下丘腦弓狀核中發(fā)現(xiàn)的.因其具有促進(jìn)垂體前葉生長激素的分泌的作用而命名為Ghrelin.Ghrelin是目前為止除了生長激素釋放激素和生長抑素外,第二個調(diào)節(jié)GH分泌的內(nèi)源性物質(zhì).Ghrelin主要合成于胃,腸垂體、下丘腦、胎盤、腎臟、胰腺等亦有少量合成.根據(jù)現(xiàn)有的資料分析,Ghrelin除調(diào)節(jié)GH分泌外,還有增加食欲

2、,調(diào)節(jié)能量平衡,促進(jìn)胃酸分泌等作用.目前關(guān)于Ghrel in在動物方面的研究較少,為了進(jìn)一步探討Ghrelin在動物中的作用機(jī)制該研究進(jìn)行了豬Ghrelin基因的克隆與表達(dá)并結(jié)合免疫組化技術(shù)對Ghrelin在體內(nèi)各組織中的分布定位進(jìn)行了初步的研究.根據(jù)Genbank中檢索豬preproghrelin mRNA序列,設(shè)計了豬Ghrelin原核表達(dá)及真核表達(dá)系統(tǒng)的引物.通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增豬的Ghrelin基因后,將其目的片段與克隆載體

3、pMD 18-T Vector連接,轉(zhuǎn)化入E.coli經(jīng)鑒定正確后,回收目的片段分別與原核表達(dá)載體pET28a(+)、真核表達(dá)載體pVAX-I的載體大片段相連接,分別構(gòu)建了豬Ghrelin的原核和真核表達(dá)系統(tǒng),首次獲得了重組菌分泌的豬Ghrelin原核表達(dá)多肽及真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX-Ghrelin cDNA.以純化的真核重組質(zhì)粒佐以司班、甘油免疫小鼠,獲取了鼠抗豬Ghrelin免疫血清,經(jīng)ELISA和Western-blot方法檢測