小麥黃花葉病毒侵染性cDNA克隆及細(xì)胞侵染體系的建立.pdf

1、在中國,由小麥黃花葉病毒(Wheatyellow mosaic virus,WYMV)引起的小麥黃花葉病已嚴(yán)重的危害了小麥的生產(chǎn).可是,由于寄主植物小麥遺傳背景復(fù)雜,寄主范圍狹窄,機(jī)械接種困難,體外病毒粒子不穩(wěn)定,病毒RNA容易降解等因素,給小麥黃花葉病毒的研究帶來了極大的困難.為了對小麥黃色花葉病毒進(jìn)行深入地分子生物學(xué)研究,從細(xì)胞及分子水平上認(rèn)識(shí)植物病毒的侵染和復(fù)制機(jī)制,該研究試圖建立一個(gè)適于WYMV侵染的室內(nèi)活體細(xì)胞侵染系統(tǒng),包括病

2、毒侵染性cDNA克隆的構(gòu)建、煙草原生質(zhì)體和小麥細(xì)胞體系的培養(yǎng),以及體外轉(zhuǎn)錄物的接種和相關(guān)的檢測技術(shù).該體系的建立為研究其它植物病毒奠定技術(shù)基礎(chǔ).該研究首先利用5′RACE方法確認(rèn)了WYMV-HC基因組的5′端的未知序列,其中RNA1的5′末端多出了15nt(5′-AAAATAAAACCACCA-3′),RNA2的5′末端則多出了12nt(5′-AAAATAAAACCA-3′).利用根據(jù)末端序列設(shè)計(jì)的引物,構(gòu)建了T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的病毒基因

3、組的全長cDNA克隆.體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果表明所獲得的cDNA克隆可以產(chǎn)生相應(yīng)的WYMV RNAs.用電擊穿孔法將體外轉(zhuǎn)錄的WYMV RNAs接種于小麥品種鄂恩1號(hào)(Triticum aestivumLEEn.No.1)的愈傷組織和煙草懸浮細(xì)胞系BY-2的原生質(zhì)體內(nèi),摸索建立了適用于WYMV病毒顆粒及體外轉(zhuǎn)錄RNA侵染植物細(xì)胞的侵染體系.對被接種細(xì)胞進(jìn)行的Western blot和Northern blot檢測結(jié)果表明,體外合成的WYMVRNA

4、s可以在煙草細(xì)胞系BY-2和小麥細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、表達(dá),即該研究所構(gòu)建的WYMV cDNA克隆具有侵染活性.進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)還證明RNA1的5′末端序列(無論是日本分離物5′末端序列還是潢川分離物的末端序列,或者是額外加的一個(gè)G對都不影響侵染性)及3′末端poly(A)尾長短(帶有26個(gè)A和4個(gè)A)對WYMV體外轉(zhuǎn)錄物的侵染活性也沒有明顯的影響.在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步完善了該侵染體系.另外,該研究還利用這一侵染體系對WYMV RNA2編碼的P1蛋白的功

5、能進(jìn)行了初步研究.通過構(gòu)建在pSKCaasSK上的GFP與P1融合基因(包括N端和C端)的瞬時(shí)表達(dá)載體,用電穿孔法轉(zhuǎn)入細(xì)胞(煙草原生質(zhì)體或小麥細(xì)胞),用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在煙草原生質(zhì)體內(nèi)集中在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)光,而在小麥愈傷細(xì)胞內(nèi),熒光集中在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、細(xì)胞膜與細(xì)胞壁上.分析可能是因?yàn)樾←準(zhǔn)遣《镜奶烊患闹?所以在小麥細(xì)胞內(nèi),由于某些因子的存在,P1表現(xiàn)其在天然寄主內(nèi)的功能,而在非天然寄主煙草細(xì)胞內(nèi),可能是因?yàn)槿狈δ承┡cP1蛋白互作的因子,P1表