磺胺嘧啶單克隆抗體的制備.pdf

1、目前磺胺藥殘留的檢測(cè)方法主要是高效液相色譜法,較為簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確,再現(xiàn)性好.但處理樣品方法涉及繁瑣、操作步驟冗長(zhǎng),需耗費(fèi)大量溶劑,費(fèi)用高,限制了該方法的廣泛使用.免疫分析是以抗原、抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù),具有常規(guī)理化分析技術(shù)無(wú)可比擬的選擇性和很高的靈敏度,非常適用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分析.而且免疫分析方法還具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn).單克隆抗體是利用細(xì)胞融合技術(shù),使骨髓瘤細(xì)胞和免疫動(dòng)物淋巴細(xì)胞融合而成的雜交瘤細(xì)胞單克隆所產(chǎn)生的

2、一種特異性高度專一和化學(xué)性高度純一的抗體.與多克隆抗體相比,它是只針對(duì)一個(gè)抗原決定基產(chǎn)生的抗體,其結(jié)構(gòu)相同,成分均一,特異性強(qiáng),生物活性高,與其它抗原沒(méi)有或極少交叉反應(yīng)等明顯的優(yōu)點(diǎn).該實(shí)驗(yàn)擬作出磺胺嘧啶的單克隆抗體,為建立磺胺嘧啶的免疫學(xué)檢測(cè)方法提供關(guān)鍵的材料.磺胺嘧啶的分子量為250,為半抗原.磺胺嘧啶分子結(jié)構(gòu)中具有芳香氨基,可進(jìn)行重氮化反應(yīng)與載體蛋白連接.該實(shí)驗(yàn)選用牛血清白蛋白(BSA)作為連接的載體.同時(shí)進(jìn)行磺胺嘧啶與卵清蛋白(0

3、VA)的偶聯(lián),產(chǎn)物用于對(duì)照和檢測(cè).用重氮化法將磺胺嘧啶偶聯(lián)到載體牛血清白蛋白和卵清蛋白上,成為完全抗原BSA-SD和OVA-SD.純化后進(jìn)行檢測(cè),確認(rèn)磺胺嘧啶已經(jīng)連接到蛋白質(zhì)上.以BSA-SD免疫Balb/c小鼠,用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià).當(dāng)效價(jià)達(dá)到1:10000以上時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞融合.融合用的骨髓瘤細(xì)胞,必須為非分泌免疫球蛋白缺陷型的細(xì)胞,且最后與制備脾細(xì)胞的小鼠為同一品系.該實(shí)驗(yàn)選用SP<,2>/0-Ag14(簡(jiǎn)稱SP<,2

4、>)型號(hào)的骨髓瘤細(xì)胞,并使其處于生長(zhǎng)旺盛的狀態(tài).細(xì)胞融合前必須進(jìn)行飼養(yǎng)細(xì)胞的制備.選用與骨髓瘤細(xì)胞同系的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞.飼養(yǎng)細(xì)胞一方面可提供雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需的群體環(huán)境,另一方面可吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片,還可以分泌各種生長(zhǎng)因子,促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的增殖.制備通常在融合前一天進(jìn)行.可供選擇的細(xì)胞融合的方法有物理法如電融合、激光融合、化學(xué)法和生物融合法.該實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)法,融合劑為分子量為1000的聚乙二醇(PEG-1000).融合

5、的過(guò)程是在50ml滅菌離心管中進(jìn)行.按一定的比例將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞置于離心管內(nèi),使之充分接觸,按嚴(yán)格的劑量逐滴加入融合劑使細(xì)胞發(fā)生融合.然后加入合適的培養(yǎng)基,滴加到鋪滿飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng).第二天檢查是否污染.一般在第6天左右,可見(jiàn)小克隆.當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板時(shí),取細(xì)胞上清液,用間接ELISA進(jìn)行陽(yáng)性孔的篩選.對(duì)篩選為陽(yáng)性的細(xì)胞,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).陽(yáng)性細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板時(shí),采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆.經(jīng)過(guò)兩到三次亞克隆后,將得到的陽(yáng)性細(xì)胞注入小鼠