抗真菌肽基因AFP的克隆和植物表達載體的構建及牧草遺傳轉化的研究.pdf

1、真菌病害是限制牧草生長的主要因素之一,每年由于真菌病害給牧草和草坪草帶來了很大的經(jīng)濟損失.造成牧草產(chǎn)量下降,品質變劣;草坪草褪色、黃化甚至枯死,影響草坪質量降低利用年限.傳統(tǒng)的對真菌防治方法采用施用殺菌劑和農(nóng)藥,這會帶來環(huán)境的污染,危害人類的身體健康.而基因工程技術的興起,為我們提供了新的研究方法.本研究采用RT-PCR方法,從蘿卜葉片中提取總RNA進行反轉錄得到cDNA,通過設計PCR擴增特異,克隆得到抗真菌肽(antifungal

2、protein)基因,與pUC<,m>-T easy vector連接,轉化E.coli DH5 α,得到重組子pUC<,m>AFP,經(jīng)酶切和序列分析鑒定,改片段分子大小為240bp,通過序列對比分析發(fā)現(xiàn)與genebank中已發(fā)表的AFP堿基序列一致,有100.00﹪的同源性,將其序列翻譯成蛋白沒有終止子的出現(xiàn),表明可以進行原核表達和植物載體轉化實驗.將此抗真菌肽基因克隆到E.coli表達載體pET28a,在IPTG的誘導下表達出含有A

3、FP的11.99 OD,證明該AFP基因在原核表達系統(tǒng)中可以正常表達.從水稻葉片中提取基因組DNA,設計PCR擴增特異引物,克隆單子葉特異表達啟動子Actinl基因,與pUC<,m>-T easy vector連接,轉化E.coli DH5 α,得到重組子pUC<,m>Act,經(jīng)酶切和序列分析鑒定,該片段分子大小為1238bp,通過序列對比分析發(fā)現(xiàn)與己發(fā)表的Actinl堿基序列有99.60﹪的同源性.構建Actinl啟動子基因驅動的AF