番茄葉綠體抗氧化酶基因的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文番茄葉綠體抗氧化酶基因的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化的研究姓名：王偉青申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：孟慶偉2003.6.1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘 要植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧能被超氧化物歧化酶( S O D ) 、抗壞血酸過氧化物酶( A P X ) 等抗氧化酶清除。超氧陰離子自由基在S O D 的催化下，通過歧化反應(yīng)產(chǎn)生H 2 0 2 ?？箟难徇^氧化物酶( A P X ) 是一種清除H 2 0 2的關(guān)鍵酶，它對于保

2、護(hù)葉綠體和其它細(xì)胞組分免受H 2 0 2 及其所產(chǎn)生的羥基自由基的破壞是必不可少的。本文以抗冷性不同的兩個番茄品種( 系) 為試材，測定了低溫脅迫下抗氧化酶活性，克隆了番茄葉綠體A P X 和C u ／Z n —S O D 基因，并轉(zhuǎn)化煙草，的活性影響。在低溫處理的最初4h ，番茄葉片的S O D 、A P X 、P O D活性均上升。S O D 、A P X 、C A T 活性分別在處理的6 h 、6 h 、2h 時達(dá)到峰值，然后下降

3、。在低溫脅迫初期，抗冷性較強(qiáng)的番茄品種L 4 0 2的酶活性上升速度明顯快于中雜7 號，而達(dá)峰值后酶活性的下降明顯慢于中雜7 號。P O D 活性則隨低溫處理時間延長而持續(xù)增強(qiáng)。2 ．根據(jù)其它植物已知的類囊體膜A P X 的氨基酸保守序列設(shè)計兼并引物，以抗冷性較強(qiáng)的L 4 0 2 低溫處理6 h 的葉片為材料，利用R T —P C R 法得到了一個約4 0 5 b p 的基因片段。經(jīng)測序和B L A S T 分析表明，該片段與其它植物類

4、囊體膜A P X 基因具有較高的同源性，是番茄類囊體膜A P X 基因片段，并在G e n e B a n k 登記( A F 4 1 3 5 7 3 ) 。3 ．根據(jù)獲得序列設(shè)計引物進(jìn)行3 ’和5 ’R A C E ．P C R ，并進(jìn)一步獲得番茄類囊體膜A P X 基因的全長。4 ．從低溫處理6h 的番茄品種L 4 0 2 的葉片中提取總R N A ，用R T ．P C R的方法擴(kuò)增C u ／Z n ．S O D 的c D N A

5、，所克隆的C u ／Z n ．S O D c D N A 序列全長為9 6 2 b p ，編碼2 1 7 個氨基酸。用G e n B a n k 中的B L A S T 進(jìn)行序列分析，該序列與菠菜、豌豆、擬南芥C u ／Z n ．S O D 的同源性分別是8 2 ％、8 2 ％、8 0 ％。說明已經(jīng)獲得了番茄品種L 4 0 2 的葉綠體C u ／Z n —S O D 序列，并在G e n B a n k 注冊( A F 5 2 7 8