小麥赤霉?、蛐涂剐詸C理研究及相關基因的功能鑒定.pdf

1、小麥赤霉病抗源極其有限，抗性種質(zhì)以II型（抗延展型）抗性為主。雖然前人對其抗病機理研究已經(jīng)開展了大量工作，但是由于其本身的復雜性，目前對小麥赤霉病II型抗性的分子機制和調(diào)控網(wǎng)絡尚不清楚。本研究以最具代表性的赤霉病II型抗性小麥品種蘇麥3號為研究材料，首先對禾谷鐮刀菌侵染小穗不同階段取材進行轉錄組數(shù)據(jù)測定，并以此為研究基礎，分析赤霉病II型抗性的抗病機理，發(fā)掘抗病相關的抗病路徑，并結合分子生物學實驗對其關鍵調(diào)控基因進行驗證。主要研究內(nèi)容如

2、下：
　　1.接菌處理后0h、12h、24h、48h、72h和96h，分別取接菌穗及相鄰穗軸進行RNA提取及cDNA文庫構建，并通過Illumina HiSeq2000測序平臺進行測序。利用中國春的基因注釋文件作為參考基因組，使用Hisat、Htseq和DEseq等分析軟件對轉錄組數(shù)據(jù)進行兩兩比較，尋找禾谷鐮刀菌處理不同時間后的差異表達基因。以Pval<0.05作為顯著差異表達評價標準，發(fā)現(xiàn)處理不同時間材料之間的差異表達基因平均有

3、2287個，而且不同時間點的差異表達基因的數(shù)目存在很大差異。通過GO注釋與富集、KEGG分析以及Mapman對差異基因進行可視化處理。發(fā)現(xiàn)小麥在受到禾谷鐮刀菌侵染后，細胞壁合成修飾及降解、光合作用、磷酸化、糖代謝途徑、激素代謝和信號傳導以及去毒化過程的一些基因受到顯著調(diào)控。其中SA和JA激素合成及信號傳導途徑分別在禾谷鐮刀菌侵染前期和后期受到顯著調(diào)控，對其信號傳導通路上關鍵基因進行表達分析發(fā)現(xiàn)，SA和JA均對小麥赤霉病產(chǎn)生響應，但是SA

4、主要在禾谷鐮刀菌侵染0-24h產(chǎn)生響應，而JA對赤霉病的響應時間晚于SA。
　　2.為了驗證SA和JA信號通路參與赤霉病抗病過程，本實驗對小麥穗部和葉片分別進行了外源激素處理。結果發(fā)現(xiàn)，外源施加SA和MeJA可以提高小麥穗部赤霉病抗病能力，其中在感病材料中更加明顯；SA處理小麥葉片后，葉片的抗病能力提高，但是，MeJA處理反而降低了葉片對禾谷鐮刀菌的抵抗能力。說明，SA可以提高小麥植株的整體赤霉病抗性，而JA在小麥穗部和葉片可能存

5、在不同的調(diào)控機制。
　　3. NPR1轉錄調(diào)控因子在模式植物中已經(jīng)驗證為SA信號通路關鍵調(diào)控因子。為了明確SA和JA交叉反應及其在赤霉病抗性中的作用，本研究對小麥NPR1基因進行了表達分析。結果發(fā)現(xiàn)在小麥中TaNPR1可以受到禾谷鐮刀菌的正向調(diào)控，與JA信號通路的趨勢一致。而外源激素處理進一步證實其受JA調(diào)控，不受SA響應。另外，其同源基因TaNPR2和TaNPR3可以受SA和JA激素的雙重調(diào)控。說明，NPR1在雙子葉植物中參與了

6、不同于單子葉植物的調(diào)控路徑，而且，SA和JA信號傳導路徑在單子葉和雙子葉植物中存在不同的調(diào)控機制。
　　4.為了進一步確認SA和JA的抗赤霉病功能，本研究利用BSMV-VIGS體系在小麥穗部對SA生物合成及信號傳導關鍵基因TaNPR1、TaOPR3和TaICS1等進行沉默并進行抗病性鑒定，結果表明TaOPR3和TaICS1基因被沉默后小麥的赤霉病抗性與空載對照相比顯著降低，發(fā)病小穗數(shù)明顯增多；而沉默TaNPR1基因后小麥赤霉病抗性

7、沒有發(fā)生很大的變化，說明SA能夠顯著提高小麥赤霉病抗性，而TaNPR1基因可能不參與小麥的SA信號通路，而是通過其他信號路徑發(fā)揮抗病作用。
　　5.為進一步深入研究SA的功能，本研究對禾谷鐮刀菌侵染小麥過程進行了ROS染色，結果發(fā)現(xiàn)接菌處理可以誘導接菌小穗ROS的產(chǎn)生，造成接菌穗的HR反應，從而抑制病原菌的萌發(fā)和蔓延，提高小麥對赤霉病的抗延展能力。
　　6. DON是一種由赤霉菌產(chǎn)生的真菌毒素，它可以促進病原菌在植物體內(nèi)的擴

8、散。UGT家族成員能夠將游離態(tài)的DON轉變成低毒力的D3G，但是目前還很少在小麥抗赤霉病研究中見到此類報道。本研究中根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)病原菌侵染后期大量的UGT基因被誘導表達，根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)分析結果發(fā)現(xiàn)了一個在抗赤霉病小麥品種中特異表達，而且對DON和禾谷鐮刀菌產(chǎn)生強烈響應的UGT家族成員TaUGT5。該基因擁有一個1431bp的ORF，可以編碼476個氨基酸殘基；利用中國春缺-四體材料將其定位于2B染色體；在中國春參考基因組A、B和D

9、染色體組分別存在一個等位基因，但是只有2B染色體上的基因能夠表達；過表達TaUGT5轉基因擬南芥植株對DON毒素表現(xiàn)出較高的耐受性；在小麥中過表達TaUGT5，轉基因植株的胚芽鞘抗赤霉病鑒定結果表明，轉基因植株能夠有效地抑制禾谷鐮刀菌在胚芽鞘的蔓延速度；但是穗部和葉片的鑒定結果對赤霉病的抗性沒有在胚芽鞘中表現(xiàn)的那么明顯。亞細胞定位研究將TaUGT5編碼蛋白定位于細胞膜上，這可能與TaUGT5的生物學功能有關，該基因的編碼蛋白能夠減少DO