牛副結(jié)核病診斷方法的建立及其初步應用.pdf

1、牛副結(jié)核病是由副結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性消化系統(tǒng)疾病，副結(jié)核分枝桿菌能引起感染牛的產(chǎn)奶量下降、持續(xù)性消瘦、頑固性下痢甚至死亡，給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，同時有研究表明該菌與人的克羅恩病有關(guān)，因此該病引起了研究人員越來越多的關(guān)注。副結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，具有較強的環(huán)境抵抗力，牛通常在幼年期經(jīng)口感染該菌并具有一個較長的亞臨床期，后期才表現(xiàn)出臨床癥狀。目前對于牛副結(jié)核病尚無有效的治療方法，及時發(fā)現(xiàn)并淘汰感染牛是凈化牛場最有效的方法

2、，由于機體感染該菌后存在細胞免疫與體液免疫分離的特點，給該病的及時檢測帶來了很大困難，前期研究發(fā)現(xiàn)該病在感染前期以細胞免疫為主并伴隨著間歇排菌，經(jīng)過2到5年亞臨床期后體液免疫應答增強，同時排菌量明顯增加，針對感染后的不同時期，幾種檢測方法的敏感性與特異性存在較大的差異，加之副結(jié)核分枝桿菌與牛結(jié)核分枝桿菌以及其他環(huán)境分枝桿菌存在高度同源性，給牛副結(jié)核病診斷帶來了很大的困難。所以，建立理想的牛副結(jié)核病檢測方法有利于及早發(fā)現(xiàn)感染牛并及時淘汰出

3、群，對該病在牛場凈化具有很大的幫助?；谂８苯Y(jié)核病的免疫學規(guī)律，研究副結(jié)核病的診斷方法，以及不同診斷方法適用于副結(jié)核感染的不同時期具有重要意義。
　　本論文主要研究了牛副結(jié)核病原學檢測和體液免疫檢測方法，并對所建立的方法與常規(guī)變態(tài)反應進行了比較，分析了各種方法檢測的特點。
　　病原學檢測方法研究中，本研究將草分枝桿菌用甘油瓊脂復蘇后，轉(zhuǎn)接到甘油肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，采用蒸餾法，結(jié)合石油醚反復抽提，成功制備了草分枝菌素。將草分

4、枝菌素按1％加入潘氏培養(yǎng)基中，成功制備適合副結(jié)核分枝桿菌生長的培養(yǎng)基。用副結(jié)核分枝桿菌參考株P(guān)18對制備的培養(yǎng)基進行了驗證，結(jié)果表明，本研究制備的副結(jié)核培養(yǎng)基對副結(jié)核分枝桿菌具有良好的培養(yǎng)能力。根據(jù)副結(jié)核特異性插入序列IS900，設計引物一對特異性引物（IS900 F和IS900 R），建立了能夠檢測副結(jié)核分枝桿菌的特異性PCR方法，并用4株副結(jié)核分枝桿菌，以及牛結(jié)核分枝桿菌、草分枝桿菌、禽結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌進行了驗證，證實了該

5、方法良好的敏感性和特異性。使用建立的PCR檢測方法，對山東地區(qū)采集的300份糞便樣品進行檢測，其中有38份為陽性。
　　血清學檢測方法研究中，我們采用大腸桿菌原核系統(tǒng)，克隆表達了5個副結(jié)核特異性蛋白MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963，將表達產(chǎn)物純化并定量后，初步建立針對各蛋白抗體的ELISA檢測方法，并用臨床樣本對5個重組蛋白在血清學診斷中的作用進行研究，結(jié)果MAP0862與MAP134

6、5具有較好的診斷價值，對300份臨床血清的檢測結(jié)果表明，兩者與IDEXX牛副結(jié)核檢測試劑盒的符合率分別為94.3%與93.7%。同時還將具有良好抗原性的兩個基因MAP0862與MAP1345進行串聯(lián)表達，并探索串聯(lián)表達蛋白在血清學診斷中的作用,結(jié)果串聯(lián)表達的MAP0862-1345與兩個蛋白在單獨存在的情況下診斷效果類似，其與IDEXX副結(jié)核檢測試劑盒的總符合率為92.7%。使用初步建立的基于不同副結(jié)核特異性蛋白的間接ELISA方法對實

7、驗室保存的人工感染副結(jié)核后不同時期的牛血清進行檢測，研究感染后不同時期血清中針對幾種特異性蛋白的抗體變化規(guī)律。通過對特異性表達蛋白的結(jié)構(gòu)分析，選擇各蛋白強抗原表位進行了化學合成，探索合成多肽在血清學診斷中的作用,結(jié)果基于MAP0862的2#多肽與基于MAP1345的3#多肽具有良好的診斷價值。
　　對山東某牛場300頭青年牛分別用本研究所建立的PCR方法和針對特異性蛋白的ELISA方法，以及經(jīng)典的皮膚變態(tài)反應，商品化ELISA方法