Bmbuffy基因家蠶細(xì)胞內(nèi)湖性線粒體凋亡途徑與細(xì)胞自噬中的功能研究.pdf

1、凋亡(Apoptosis)是一個(gè)生理性的由基因調(diào)控的高度保守的死亡過程，它在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和防御外在傷害等方面起著重要作用。細(xì)胞凋亡對機(jī)體的生長、發(fā)育及維持正常生理功能都有著重要意義。在昆蟲細(xì)胞中，對凋亡調(diào)控機(jī)制的研究近些年雖取得了一些進(jìn)展，但無論從深度或廣度來說都還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，這還需要不斷探索與研究。家蠶作為鱗翅目昆蟲的代表，同時(shí)也作為一種經(jīng)濟(jì)昆蟲，其研究應(yīng)用價(jià)值逐漸提高。家蠶是一種完全變態(tài)的昆蟲，在其每次變態(tài)和蛻皮生長發(fā)育過程中

2、細(xì)胞凋亡起到至關(guān)重要的作用，細(xì)胞凋亡的正常調(diào)控成為了其正常發(fā)育機(jī)制的基礎(chǔ)。然而，家蠶凋亡機(jī)制的研究目前尚處于初級探索階段，如何著手深入探究和揭示家蠶細(xì)胞凋亡的基本機(jī)制成為現(xiàn)階段迫切需要解決的問題。
　　細(xì)胞凋亡途徑主要有三種通路:線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路，而且各種通路之間相互聯(lián)系，共同介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中線粒體通路起到?jīng)Q定性作用。因此，研究線粒體通路是了解凋亡調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2蛋白家族行使著重

3、要的功能，它們之間相互作用或與其它蛋白相互作用，共同對線粒體通路進(jìn)行調(diào)控。在家蠶中，Bmbuffy是目前已鑒定的Bcl-2家族同源基因，但其具體功能還完全未知。鑒于此，本文對Bmbuffy基因在線粒體內(nèi)源性凋亡途徑中的功能進(jìn)行了研究。
　　作為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡方式，細(xì)胞自噬在機(jī)體生長發(fā)育、清除自身多余物質(zhì)完成代謝更新、抵抗外界壓力及有害微生物侵襲，以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性方面具有重要作用。近些年，細(xì)胞自噬已成為研究熱點(diǎn)。自噬與凋亡之

4、間既相互獨(dú)立又相互聯(lián)系:一方面，自噬可先于凋亡發(fā)生，并向凋亡轉(zhuǎn)換;另一方面，自噬可抑制凋亡，維持細(xì)胞存活。自噬過程涉及到許多相關(guān)分子的參與，其中，與凋亡相關(guān)的Bcl-2蛋白家族也在自噬過程中發(fā)揮作用。Bmbuffy作為Bcl-2家族的同源基因，是否在家蠶細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮作用，這成為本文的另一研究重點(diǎn)。本文所得研究結(jié)果如下:
　　1.羥基喜樹堿(HCPT)介導(dǎo)家蠶BmN-SWU1細(xì)胞線粒體凋亡通路研究
　　HCPT處理細(xì)胞一

5、定時(shí)間后，細(xì)胞核呈現(xiàn)了凋亡特征、核內(nèi)DNA發(fā)生片段化、細(xì)胞活力逐漸降低、細(xì)胞凋亡率升高，由此證明HCPT能夠誘導(dǎo)家蠶BmN-SWU1細(xì)胞凋亡。接著本研究對HCPT引起家蠶細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性通路進(jìn)行了探討。通過檢測線粒體分布及線粒體膜電位變化、細(xì)胞色素c的釋放，發(fā)現(xiàn)HCPT能使線粒體的分布從均勻集中變?yōu)榱鑱y散在，并導(dǎo)致線粒體膜電位的下降及細(xì)胞色素c的釋放。利用環(huán)孢菌素A(CsA)及Bax五肽抑制劑(Bip-V5)處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素c的

6、釋放與細(xì)胞凋亡率受到抑制，表明細(xì)胞色素c的釋放依賴于通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的打開及線粒體外膜通透性(MOMP)的增加。通過檢測Caspase酶活性變化，發(fā)現(xiàn)HCPT能促進(jìn)Caspase-9與-3的活性，當(dāng)加入Apaf-1抑制劑后，Caspase-3的活性受到抑制，由此表明，Pro-Caspase-3活性的激活依賴于凋亡復(fù)合體的形成。據(jù)此得出結(jié)論:HCPT通過內(nèi)源性線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞凋亡。
　　2.Bmbuffy基因在家蠶

7、細(xì)胞內(nèi)源性線粒體凋亡途徑中的功能研究
　　對Bmbuffy在家蠶細(xì)胞中的定位研究發(fā)現(xiàn):Bmbuffy定位于線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上，而缺失掉C末端疏水結(jié)構(gòu)域的Bmbuffy-△TM則散在分布于細(xì)胞質(zhì)與核中，表明C末端疏水結(jié)構(gòu)域能將Bmbuffy錨定在線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上。檢測Bmbuffy基因?qū)倚Q細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示:在HCPT誘導(dǎo)的家蠶細(xì)胞中，過表達(dá)Bmbuffy基因能抑制細(xì)胞色素c的釋放、Caspase-3酶活性及細(xì)胞凋亡率

8、，同時(shí)對細(xì)胞增殖活力具有促進(jìn)作用，表明Bmbuffy對家蠶細(xì)胞凋亡具有抑制作用，而缺失掉C末端疏水結(jié)構(gòu)域的Bmbuffy卻沒有此功能，表明Bmbuffy的C末端跨膜疏水結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涔δ艿男惺咕哂兄匾饔?。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):當(dāng)HCPT誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞后，Bmp53從核內(nèi)逐漸轉(zhuǎn)位到線粒體上，與位于線粒體外膜上的Bmbuffy相互作用，抑制Bmbuffy的抑凋亡功能，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。過表達(dá)Bmbuffy基因能抑制Bmp53基因的促凋亡效應(yīng)，說明Bm

9、buffy與Bmp53之間存在相互拮抗的關(guān)系。
　　3.Bmbuffy基因在家蠶細(xì)胞自噬中的功能研究
　　用昆蟲細(xì)胞平衡緩沖液(IBSS)處理BmN-SWU1細(xì)胞一定時(shí)間后，通過MDA染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞出現(xiàn)了自噬現(xiàn)象，表明經(jīng)IBSS處理的細(xì)胞受到了饑餓誘導(dǎo)，從而發(fā)生自噬。過表達(dá)Bmbuffy基因能夠抑制IBSS介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，說明Bmbuffy對家蠶細(xì)胞自噬具有抑制作用。通過研究Bmbuffy與BmAtg6相互作用發(fā)現(xiàn):正常細(xì)胞

10、中，Bmbuffy與BmAtg6相互作用，抑制自噬的發(fā)生;當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，Bmbuffy與BmAtg6相互解離。經(jīng)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明:Bmbuffy通過BH結(jié)構(gòu)域與BmAtg6相互作用，且位于其145位的苯丙氨酸(F)在Bmbuffy與BmAtg6相互結(jié)合中起關(guān)鍵作用。通過構(gòu)建PIZ-Bmbuffy-ActA-TM-dsRed與PIZ-Bmbuffy-cb5-TM-dsRed載體，將Bmbuffy分別定向錨定在線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上，