肽聚糖對(duì)siRNA抑制凡納濱對(duì)蝦WSSV的強(qiáng)化及其轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、近年來，WSSV感染致病率有所下降，但是WSSV感染在一定條件下仍然是對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要威脅，因此研究對(duì)蝦抗WSSV治療及其機(jī)理具有重要意義。肽聚糖對(duì)對(duì)蝦的免疫效果較低，同樣siRNA干擾也不能有效抵抗WSSV感染和發(fā)病，其免疫保護(hù)也較低。試驗(yàn)設(shè)計(jì)在強(qiáng)化免疫條件下，WSSV感染后發(fā)病狀況變化，再利用siRNA干擾技術(shù)，觀察對(duì)蝦WSSV感染后，其保護(hù)率的變化，期望探討對(duì)蝦抗病毒免疫機(jī)理和抗WSSV的治療技術(shù)，并為在親本的有效實(shí)用的病毒防治上提

2、供技術(shù)與理論基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容有以下三個(gè)方面。(1)利用超聲波溶解從溶藻弧菌細(xì)胞壁中提取出的肽聚糖，注射到凡納濱對(duì)蝦肌肉內(nèi)，再感染W(wǎng)SSV。在不同時(shí)間點(diǎn)記錄凡納濱對(duì)蝦死亡數(shù)，試劑盒法測(cè)定對(duì)蝦免疫學(xué)指標(biāo)。(2)確定vp28-siRNA干擾WSSV最佳濃度，在凡納濱對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV第24h時(shí)，把最佳濃度的vp28-siRNA注射到凡納濱對(duì)蝦，利用半定量PCR和熒光定量檢測(cè)在不同時(shí)間點(diǎn)確定siRNA干擾效果。(3)凡納濱對(duì)蝦在

3、注射肽聚糖后，感染W(wǎng)SSV，不同時(shí)間點(diǎn)注射vp28-siRNA，檢測(cè)對(duì)蝦免疫保護(hù)率。
　　基于上面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采集五個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦的肝胰腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析。具體研究結(jié)果與分析如下:
　　1.實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證WSSV病毒毒性，接著凡納對(duì)蝦分別注射0.05mg/mL（PSA組）、0.1mg/mL（PSB組）和0.15mg/mL（PSC組）的肽聚糖，進(jìn)行免疫刺激24h后感染W(wǎng)SSV，測(cè)定其免疫保護(hù)率和肝胰腺、血清中的免疫學(xué)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)

4、結(jié)果表明:超低溫保存的WSSV粗提液在對(duì)蝦體內(nèi)復(fù)活后重新提取的粗提液，經(jīng)PCR檢測(cè)顯示W(wǎng)SSV呈陽(yáng)性;注射到凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)，第1天后出現(xiàn)大量死亡數(shù);對(duì)死亡對(duì)蝦PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示W(wǎng)SSV呈陽(yáng)性，證明WSSV具有較強(qiáng)的感染性。與對(duì)照組相比，PSA組的保護(hù)率為36.67％，PSB組為46.67％，PSC組為56.67％;對(duì)蝦的保護(hù)率隨著肽聚糖的濃度增大而增大。凡納濱對(duì)蝦血清中的PO酶活的情況如下: PSA組在72h時(shí)達(dá)到最大值，PSB組在4

5、8h時(shí)達(dá)到最大值，PSC組也在24h時(shí)達(dá)到最大值。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦肝胰腺中的ACP、AKP、SOD和NOS酶活與對(duì)照組相比，有極顯著性的差異(P＜0.01)。PSA組ACP在24h時(shí)達(dá)到最大值，AKP在第12h時(shí)達(dá)到最大值，SOD在48h時(shí)達(dá)到最大，NOS在24h時(shí)達(dá)到最大值;PSB組ACP、AKP和SOD都在48h時(shí)達(dá)到最大值，NOS在12h時(shí)達(dá)到最大值，但在96h時(shí)又有一個(gè)高峰;PSC組ACP和AKP在24h時(shí)達(dá)到最大值，SOD在1

6、2h時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸減少，在72h時(shí)又達(dá)到一個(gè)高峰，NOS在第6h時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸減少。
　　2.確定了siRNA最佳濃度為0.1μg/μL，每尾注射100μL時(shí)，干擾效果是最好，同時(shí)得到其保護(hù)率為40％。熒光定量檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)病毒拷貝數(shù)，結(jié)果表明在第48h時(shí)能很好干擾WSSV病毒復(fù)制，干擾效果呈現(xiàn)持續(xù)到第120h。
　　3.0.1mg/mL肽聚糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行免疫24h，感染W(wǎng)SSV之后不同時(shí)間點(diǎn)注射vp

7、28-siRNA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:6h注射組的保護(hù)率為80％，12h注射組為63.33％，24h注射組為56.67％。保護(hù)率比單注射siRNA或肽聚糖的保護(hù)率高。
　　4.采集五個(gè)組的肝胰腺進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析。通過Illumina Hiseq2000平臺(tái)測(cè)序，總計(jì)產(chǎn)出24，001，958，340nt數(shù)據(jù)。組裝結(jié)果總Unigene35，274個(gè)，總長(zhǎng)38，807，225nt，平均長(zhǎng)度1，100nt，N50達(dá)到2，012nt。差異表