鴨源新城疫病毒對雁鵝的致病性研究.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起禽類的一種高度接觸性、急性敗血性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定為A類動(dòng)物疫病，被中國列為Ⅰ類動(dòng)物傳染病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)最重要的傳染病之一。NDV可以引起禽類呼吸道、消化道黏膜出血，出現(xiàn)扭頭、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀。傳統(tǒng)理論認(rèn)為NDV不感染水禽，即使感染也不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。但近年來，NDV出現(xiàn)了某些新的致病

2、特點(diǎn)，特別是對鵝表現(xiàn)為較強(qiáng)的致病性，加強(qiáng)該病的研究，對保護(hù)和促進(jìn)我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展具有重要意義。
　　本研究選用60只15d健康雁鵝，隨機(jī)分為靜脈注射組、肌肉注射組、點(diǎn)眼滴鼻組和對照組，每組15只。利用分離的鴨源新城疫病毒(NDV) SDFC株通過靜脈注射、肌肉注射、點(diǎn)眼滴鼻三種途徑人工感染15d雁鵝，每只接種10-8.2ELD50/0.2 mL尿囊液，觀察試驗(yàn)鵝的發(fā)病情況及臨床癥狀，于感染后不同時(shí)間剖殺，觀察各組織器官的主要剖檢變

3、化，采集血液檢測血液生化指標(biāo)和細(xì)胞因子，并采集各組織器官按常規(guī)方法制備石蠟切片、HE染色，觀察其病理組織學(xué)變化。結(jié)果顯示，試驗(yàn)鵝感染鴨源NDV后發(fā)病率達(dá)45/45，靜脈注射組死亡只數(shù)為12/15，肌肉注射組死亡只數(shù)為6/15，點(diǎn)眼滴鼻組死亡只數(shù)為4/15。病鵝表現(xiàn)下痢、流淚，部分鵝出現(xiàn)癱瘓、扭頭、角弓反張等神經(jīng)癥狀;剖檢變化表現(xiàn)為胰腺、脾臟有大小不等的白色壞死灶，胸腺、法氏囊萎縮，心包積液，腸道、肝臟、肺臟、腎臟出血;血液生化指標(biāo)檢測結(jié)

4、果顯示，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮（BUN）、尿酸(UA)、總蛋白(TP)等均呈先上升后下降的趨勢，與對照組差異顯著(P＜0.05);各攻毒組的IL-6、IFN-γ水平明顯高于對照組;病理組織學(xué)變化表現(xiàn)為胸腺、脾臟、法氏囊等器官內(nèi)淋巴細(xì)胞壞死、崩解，心臟、肺臟、肝臟、腎臟廣泛性出血、變性。
　　用免疫組化染色技術(shù)，對試驗(yàn)組病鵝不同時(shí)間所采集的各組織器官進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，從胰腺、腺胃、腸道、胸腺、脾臟、法氏

5、囊、腦、腎臟、氣管、肺臟、心臟、肝臟等多種組織中均能檢測到陽性信號，其中腸道、胰腺、胸腺、脾臟、法氏囊、腎臟、心臟、腦的陽性率較高，但肌肉注射組和點(diǎn)眼滴鼻組各組織器官的陽性信號數(shù)量少于靜脈注射組。
　　以F基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)并合成170bp的特異性引物，同時(shí)以β-actin為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)并合成139 bp的特異性引物?；厥誔CR產(chǎn)物并連接到pMD18-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，篩選陽性質(zhì)粒并純化，將純化好的陽性質(zhì)粒倍比稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品

6、，用于構(gòu)建SYBRGreenⅠ熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)結(jié)果顯示，構(gòu)建的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測方法最小檢出模板濃度約為50 Copies/μL，F(xiàn)基因和β-actin基因的Ct值與構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品濃度的線性關(guān)系良好，R2值均在0.99以上;特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)基因和β-actin的熔解曲線有單一的峰值，說明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的產(chǎn)生;重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)基因和β-actin的批內(nèi)、批

7、間變異系數(shù)均小于1.6％。上述結(jié)果顯示，本研究建立的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法快速、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以用于NDV早期檢測。
　　應(yīng)用已建立的熒光定量RT-PCR方法檢測人工感染雁鵝不同組織在不同時(shí)間病毒載量的變化。結(jié)果顯示，經(jīng)不同途徑接種的NDV可以存在于雁鵝體內(nèi)所有的組織器官，但不同組織病毒載量和感染持續(xù)時(shí)間不同。靜脈注射攻毒后2-10d，在所檢測的各組織中均有病毒存在;肌肉注射攻毒后2-8 d，