豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因表達(dá)及重組蛋白ELISA方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovurus type 2,PCV2)是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征等相關(guān)疾病的重要病原.PCV2的ORF2基因不僅是其主要結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因,而且也是區(qū)分PCV1和PCV2的重要區(qū)域,其編碼蛋白具有良好的抗原性.該研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出PCV2BF株ORF2基因,并進(jìn)行了分子克隆,成功實(shí)現(xiàn)了ORF2基因大腸桿菌中的表達(dá),對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行了初步純化,利用純化的重組蛋白初步建立了檢測(cè)PCV2檢

2、測(cè),完成6株P(guān)CV2分離毒株的全基因組序列測(cè)定與分析.1.參照GenBank發(fā)表的PCV2BF株基因序列,設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,對(duì)PCV2BF株ORF2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,呈現(xiàn)一條約720bp的特異條帶,交其回收后克隆到pGEM T-Easy載體.根據(jù)基因分析,設(shè)計(jì)一對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物,從克隆的pGEM T-ORF2重組質(zhì)粒擴(kuò)增出大小為593bp的ORF2基因片段,然后克隆到表達(dá)載體pET-32a中,經(jīng)Xhol和

3、BamHI酶切鑒定,得到陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-ORF2.2.將重組質(zhì)粒pET-ORF2轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中,經(jīng)終濃度為2mmol/L的IPTG誘導(dǎo),高效表達(dá)了ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白,重組蛋白表達(dá)量占菌體蛋白量的20％.經(jīng)Western-Blot檢測(cè)表明,表達(dá)的重組蛋白能夠被PCV2陽(yáng)性血清所識(shí)別,具有良好的抗原性.3.利用表達(dá)的重組融合蛋白作為抗原,建立了檢測(cè)PCV2抗體的間接ELISA方法,并對(duì)ELISA的反應(yīng)條

4、件進(jìn)行了摸索,確定了抗原的最適包被濃度為5μg/ml,最適包被條件為37℃1h加4℃過夜,檢測(cè)血清稀釋為1:40,HRP-兔抗豬IgG的最適工作濃度為1:400.包被的重組蛋白不與豬瘟、豬偽狂犬病、豬日本乙型腦炎、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng),表明建立的ELISA診斷方法具有良好的特異性.間接ELISA方法的建立為中國(guó)進(jìn)行PCV2的診斷與監(jiān)測(cè)以及血清學(xué)調(diào)查提供了一處技術(shù)手段.4.采用PCR技術(shù)對(duì)中國(guó)北京、天津、山東、廣東