柑橘受黃龍病菌侵染后基因差異表達(dá)分析及抗病基因同源序列克隆.pdf

1、柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）是全球柑橘產(chǎn)業(yè)最具毀滅性的病害之一。該病由韌皮部桿菌屬中的3種細(xì)菌，即亞洲韌皮部桿菌、非洲韌皮部桿菌和美洲韌皮部桿菌引起，我國的柑橘黃龍病病原則均為亞洲韌皮部桿菌（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）。近年來，國內(nèi)外對柑橘黃龍病進(jìn)行了大量的病原檢測鑒定和遺傳變異性研究，但涉及黃龍病發(fā)生機(jī)理的研究很少。本文主要開展了不同抗性柑橘品種被黃

2、龍病菌侵染后體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組變化的比較分析和抗病基因同源序列克隆的研究，目的是了解柑橘黃龍病抗性的分子機(jī)理，并為黃龍病抗病基因的利用奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和所得結(jié)果如下：
　　1.柑橘黃龍病毒源樹篩選。采用PCR方法對采自江西大余縣10棵疑似柑橘黃龍病病樹（臍橙）葉片進(jìn)行了黃龍病菌、植原體和衰退病毒的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中兩棵樹（4號和5號）只含黃龍病菌，而不含植原體和衰退病毒。這兩棵樹被認(rèn)為是理想的黃龍病毒源樹，并選擇4號毒源樹用作后續(xù)試

3、驗(yàn)。
　　2.不同柑橘品種對HLB的室內(nèi)抗性鑒定。用獲得的HLB毒源樹對不同柑橘品種進(jìn)行嫁接（芽接），之后用PCR方法定期（每月1次）檢測各品種的感染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在嫁接后3個(gè)月和4個(gè)月后分別從椪柑和琯溪蜜柚中檢測到CLas，而溫州蜜柑在嫁接8個(gè)月后仍然沒有檢測到CLas的存在。同時(shí)，在嫁接后8個(gè)月，椪柑和琯溪蜜柚各表現(xiàn)明顯和輕微的黃龍病癥狀，而溫州蜜柑仍無癥狀出現(xiàn)。表明椪柑高度感病，琯溪蜜柚次之，溫州蜜柑高度抗病。
　　

4、3.基因差異表達(dá)分析。采用基因芯片技術(shù)，對嫁接后4個(gè)月的椪柑和琯溪蜜柚植株葉片及其健康對照植株葉片進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，椪柑共有差異表達(dá)基因1106個(gè)，其中上調(diào)基因564個(gè)，下調(diào)基因542個(gè)；琯溪蜜柚共有差異表達(dá)基因910個(gè)，其中上調(diào)基因491個(gè)，下調(diào)基因419個(gè)。與韌皮部堵塞物質(zhì)相關(guān)的pp2基因在感染的椪柑和琯溪蜜柚中均呈上調(diào)表達(dá)；與半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteinase）合成相關(guān)基因在琯溪蜜柚中均為上調(diào)表達(dá)

5、，而在椪柑中存在不同程度的差異表達(dá)。許多代謝途徑如光合作用、糖類代謝、葉綠素、病程相關(guān)蛋白和GDSL脂肪酸等的基因在兩個(gè)柑橘品種中都存在著不同程度的差異表達(dá)。這些基因差異表達(dá)結(jié)果有助于闡明椪柑和琯溪蜜柚對黃龍病的抗病性差異。
　　4.抗病基因同源序列克隆。用抗病基因保守區(qū)域的簡并引物對3個(gè)柑橘品種的抗病基因同源序列（RGAs）進(jìn)行克隆并對RGAs進(jìn)行序列分析。結(jié)果共獲得26條RGAs，其中23條序列能夠翻譯成連續(xù)的氨基酸序列，其氨