飼料果膠對瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)和微生物蛋白合成影響的研究.pdf

1、果膠為一類天然高分子化合物，屬結(jié)構(gòu)性碳水化合物。苜蓿、羊草、玉米秸以及稻秸等粗飼料中均含有果膠，但以苜蓿中最為豐富。果膠與淀粉雖然同屬非纖維性碳水化合物，但發(fā)酵特性差異較大。迄今為止有關(guān)果膠影響瘤胃發(fā)酵、微生物蛋白合成的報道不多，而對果膠影響瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)以及果膠降解菌這類功能微生物的研究與認知更加有限。本研究首先探索的苜蓿日糧與玉米秸日糧下奶牛瘤胃中的差異微生物菌種或菌群，并建立果膠分解菌檢測的分子技術(shù)，從而獲取更多的果膠降解菌信

2、息;然后以湖羊為模式動物，系統(tǒng)研究了以玉米秸為粗飼料的日糧中補充添加果膠對瘤胃發(fā)酵、微生物蛋白合成以及微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響。
　　一、果膠對瘤胃微生物菌群的影響及果膠菌檢測
　　1.飼喂不同果膠含量日糧對奶牛微生物菌群的影響。本試驗檢測了苜蓿、玉米秸以及羊草三種粗飼料中的果膠含量，依次為9.3％，2.8％和3.7％（干物質(zhì)基礎(chǔ)）。通過454焦磷酸測序技術(shù)分析苜蓿日糧與玉米秸日糧下奶牛瘤胃液中的微生物16S rRNA基因，發(fā)現(xiàn)

3、Selenomonas和Treponema菌屬包括菌株T.saccharophilum是苜蓿日糧下的特有菌群，Selenomonas ruminantium的比例在苜蓿日糧中也有高于玉米秸日糧的趨勢，分析發(fā)現(xiàn)T.saccharophilum與 S.ruminantium都是降解果膠、淀粉的微生物。
　　2.不同果膠含量粗飼料組合對瘤胃微生物分布的影響。為了驗證測序發(fā)現(xiàn)的微生物差異是由日糧中果膠或/和淀粉含量差異引起的，本試驗分別對

4、苜蓿、玉米秸、果膠、淀粉以及秸稈與果膠、淀粉的組合為底物的體外發(fā)酵液中微生物菌群進行PCR-DGGE分析，發(fā)現(xiàn)玉米秸與果膠組合的DGGE條帶分布與苜蓿組相似度由67.5％增加至72％，而玉米秸與淀粉組合后與苜蓿條帶相似度從67.5％降至65％，從微生物學角度證實了果膠是秸稈與苜蓿的重要差異養(yǎng)分之一。對差異條帶克隆測序發(fā)現(xiàn)了與T.saccharophilum相似度為99％的克隆，進一步證實該菌對果膠降解的特異性。Real-time分析還發(fā)

5、現(xiàn)整個Treponema菌屬（密螺旋菌菌屬）在以淀粉為底物的條件下數(shù)量大大降低，而果膠的添加顯著促進該菌屬的生長(P＜0.05)，提示了以T.saccharophilum為代表的Treponema菌屬都與果膠降解密切相關(guān)。而S.ruminantium在果膠或淀粉為底物的發(fā)酵液中豐度差異不顯著。
　　3.果膠分解菌T.saccharophilum實時定量方法構(gòu)建與體內(nèi)外豐度檢測。由于迄今缺乏準確、可靠的檢測方法，T.saccharo

6、philum在瘤胃中的數(shù)量未知。因此，本研究設(shè)計了能夠特異性擴增T.saccharophilum16S rRNA基因的引物，驗證結(jié)果表明引物靈敏、可靠，可以應用于未來瘤胃生態(tài)研究。利用設(shè)計的引物進一步從體外、體內(nèi)角度檢測了T.saccharophilum與不同果膠含量粗飼料的關(guān)系。體外結(jié)果表明T.saccharophilum在苜蓿以及添加果膠的底物中豐度顯著高于玉米秸、羊草以及淀粉為底物(P＜0.05)時，而淀粉不支持該菌的生長;體內(nèi)結(jié)

7、果表明T.saccharophilum在苜蓿日糧飼喂的奶牛瘤胃中顯著高于羊草、玉米秸以及稻草秸日糧(P＜0.05)。通過對比瘤胃其他細菌的豐度發(fā)現(xiàn)，T.saccharophilum在瘤胃中的相對豐度較高，提示了這個菌在瘤胃中重要性，并可能擴展今后與瘤胃中的果膠代謝相關(guān)的研究。
　　二、果膠對湖羊生產(chǎn)性能、瘤胃發(fā)酵和微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響
　　1.果膠對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)與微生物蛋白合成的影響。為了評估果膠與淀粉對瘤胃發(fā)酵的影響，

8、首先進行了體外發(fā)酵，以700mg的玉米秸與150mg豆粕為底物的基礎(chǔ)上設(shè)置4個處理:(1)淀粉150mg+果膠0mg(Pe0)，(2)淀粉100mg+果膠50mg(Pe50)，(3)淀粉50mg+果膠100mg(Pe100)，(4)淀粉0mg+果膠150mg(Pe150)。結(jié)果表明，果膠體外發(fā)酵速率顯著高于淀粉(P＜0.05)，尤其是6h前的早期發(fā)酵，此外24h總產(chǎn)氣量果膠也顯著高于淀粉(P＜0.05)。果膠為底物的發(fā)酵屬于乙酸型，而淀

9、粉發(fā)酵屬于丙酸型，本試驗中乙丙比隨著果膠的增加而線性增加。Pe0與Pe50的pH值低于Pe100和Pe150(P＜0.05)，P150的MCP產(chǎn)量顯著高于Pe0（P＜0.05），提示果膠可優(yōu)化發(fā)酵速率、pH等瘤胃發(fā)酵參數(shù)，并促進微生物蛋白合成。
　　2.果膠對湖羊生長性能和瘤胃發(fā)酵的影響。為了深入研究果膠對反芻動物生產(chǎn)性能的影響，本試驗選取45只健康無病的7月齡公湖羊，按照隨機區(qū)組設(shè)計和同欄大小相近原則，根據(jù)體重分為5個處理:基礎(chǔ)

10、日糧（精粗比50∶50的全混合日糧）為對照組（Ctrl），在基礎(chǔ)日糧上分別添加2.5％和5％果膠的低果膠日糧(PeL)和高果膠日糧(PeH)，分別添加2.5％和5％淀粉的低淀粉日糧(StL)和高淀粉日糧(StH)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加果膠可以增加采食量，而添加淀粉則線性降低采食量(P＜0.05)。日糧PeH的MCP產(chǎn)量在各組中最高(P＜0.05)，且果膠的添加對MCP的生成有線性增加效應(P＜0.01)，而淀粉的添加則對MCP產(chǎn)量具有曲線降低

11、效應，即高淀粉日糧反而抑制了MCP的合成。果膠添加線性增加日增重（P＜0.05），PeH在各組中日增重最高(P＜0.05)，與其MCP合成量一致。此外，飼喂Pe日糧可顯著降低血清中甘油三脂(TG)水平(P＜0.05)。這些結(jié)果表明，與淀粉相比，添加果膠有助于瘤胃微生物蛋白合成，改善湖羊的生產(chǎn)性能。
　　3.果膠對湖羊瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響。為了深入研究與果膠降解相關(guān)的瘤胃細菌，采用Real-time以及Miseq高通量測序，深度

12、分析上述試驗中各組日糧下湖羊瘤胃微生物菌群分布情況。經(jīng)過菌門、菌科、菌屬以及OTU水平的多重比較分析，證實日糧中添加果膠形成的微生物分布與對照或淀粉處理組有顯著差異。實時定量結(jié)果表明，瘤胃已知的典型微生物中除了Treponema以及T.saccharophilum被果膠富集，多數(shù)菌偏好淀粉利用。然而，通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，果膠的添加主要富集了厚壁菌門的微生物成員，這些相關(guān)微生物多數(shù)為未培養(yǎng)或者尚未有特異引物能夠準確定量的微生物，包括該門類

13、下梭菌綱下的Mogibacteriaceae科和Lachnospiraceae（毛螺菌科）以及Erysipelotrichi（產(chǎn)芽胞菌綱）下產(chǎn)芽胞菌科的成員。其中毛螺菌科下Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）、Coprococcus（糞球菌屬）、Moryella以及一未分類屬，產(chǎn)芽胞菌科下Holdemania（霍爾德曼氏菌屬）、L7A_E11以及Bulleidia屬都表現(xiàn)出顯著的果膠特異性。
　　綜上所述，作為結(jié)構(gòu)性碳水化合物的