蘋果冷脅迫下差異表達(dá)基因的篩選及新抗逆基因MdTLP7的功能鑒定.pdf

1、植物在其整個生長發(fā)育的生命周期中面臨著各種不利的外部環(huán)境，其中，低溫是限制植物生長與分布的重要的環(huán)境因素之一，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育。利用基因工程對作物進(jìn)行遺傳改良提高其抗逆性，是保障作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和安全生產(chǎn)的有效途徑，大量植物抗逆功能基因的分離和鑒定則為基因工程遺傳改良提供了目的基因。本研究選擇較耐寒的蘋果砧木品種Mailing26(M.26)，利用Solexa高通量測序技術(shù)對冷處理的幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選出表達(dá)量顯著變化的基因

2、，對這些基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和注釋，從中尋找新的抗寒基因，為深入闡明植物耐寒性分子機(jī)理提供更多的依據(jù)。主要實驗結(jié)果如下:
　　(1)在確定M.26抗寒性敏感時間點的基礎(chǔ)上，對冷脅迫處理后的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。電導(dǎo)率和丙二醛含量分別是檢測細(xì)胞膜受損程度和衡量膜脂過氧化程度的指標(biāo)。測定冷處理幼苗葉片的電導(dǎo)率與丙二醛含量，對比M.26與蘋果栽培品種Gala抗寒性的差異，確定1h和6h可作為M.26抗寒性敏感時間點。4℃冷處理M.26葉

3、片后，提取RNA用于Solexa測序，0h、1h和6h冷處理的三個樣品分別獲得318576、300676和640732個特異性標(biāo)簽。排除假陽性標(biāo)簽、比對蘋果基因組并拼接組裝后得到了14219、11176和16116個有效基因。
　　(2)表達(dá)譜中差異表達(dá)的基因篩選及功能分析。設(shè)置差異倍數(shù)大于等于4(| log2差異倍數(shù)|=2)為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，1h與0h相比，得到139個上調(diào)基因和1499個下調(diào)的基因;6h與1h相比，獲得10

4、85個上調(diào)基因和381個下調(diào)基因，其中約40％的差異基因為未知基因。GO功能分類和KEGG Pathway分析表明差異基因參與多種通路，涉及16類細(xì)胞組分的變化包括質(zhì)體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等，10類分子功能的變化包括轉(zhuǎn)錄因子、抗氧化物、信號傳感器、酶調(diào)節(jié)物等，13類生化途徑包括代謝調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)、基因表達(dá)等，這些組分及調(diào)節(jié)的生化反應(yīng)在植物適應(yīng)冷脅迫的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　(3)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

5、分析驗證表達(dá)譜的可靠性。隨機(jī)挑選6個上調(diào)基因和5個下調(diào)基因，設(shè)計特異性引物。對M.26葉片用前述相同的方法進(jìn)行冷脅迫處理，提取RNA后，利用qRT-PCR檢測這11個基因的相對表達(dá)量并與表達(dá)譜結(jié)果對比，qRT-PCR所得結(jié)果與表達(dá)譜中11個基因表達(dá)量的變化趨勢一致，表明表達(dá)譜的結(jié)果是可靠的。
　　(4)克隆得到新抗逆基因，分析其編碼蛋白MdTLP7(Tubby-like protein7)的結(jié)構(gòu)特征。從冷脅迫差異基因表達(dá)譜中，我們

6、發(fā)現(xiàn)了一個動物肥胖基因（Tubby）同源物，該基因的表達(dá)量在4℃冷處理6h時顯著上調(diào)表達(dá)，暗示著它在植物非生物脅迫中起重要作用。從蘋果的cDNA文庫中我們克隆得到了該基因，其編碼區(qū)長度1245-bp，編碼含415個氨基酸的蛋白質(zhì)，我們稱之為MdTLP7。與動物TLP蛋白只有Tubby結(jié)構(gòu)域不同，MdTLP7從N-端到C-端由前導(dǎo)肽、F-box結(jié)構(gòu)域和Tubby結(jié)構(gòu)域組成。
　　(5) MdTLP7抗逆功能鑒定。構(gòu)建原核表達(dá)載體，將

7、MdTLP7轉(zhuǎn)入大腸桿菌。在固體和液體培養(yǎng)下對大腸桿菌細(xì)胞分別進(jìn)行4℃、50℃、0.5M NaCl和0.5M KCl脅迫處理，檢測MdTLP7重組表達(dá)對細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示，上述脅迫條件下，包含MdTLP7重組質(zhì)粒的菌株其存活率和生長速率都明顯高于對照菌株，表明MdTLP7的表達(dá)顯著增強(qiáng)了原核細(xì)胞抵抗鹽與溫度脅迫的能力。
　　(6) MdTLP7功能區(qū)域分析。根據(jù)MdTLP7的結(jié)構(gòu)特點，分別從N-末端和C-末端設(shè)計系列缺失突變

8、體，重組表達(dá)后結(jié)果表明，缺失前導(dǎo)肽與F-box結(jié)構(gòu)域后，MdTLP7抗逆功能與野生型相比沒有明顯變化，而Tubby結(jié)構(gòu)域的缺失顯著降低了MdTLP7的抗逆能力，在120-415氨基酸片段的Tubby結(jié)構(gòu)域中，120-310氨基酸片段對MdTLP7的抗逆能力作用最重要。三維模擬Tubby結(jié)構(gòu)域，由一個β桶包圍中心的α螺旋組成，120-310氨基酸片段組成β桶部分結(jié)構(gòu)，說明Tubby結(jié)構(gòu)域的β桶結(jié)構(gòu)對該蛋白的抗逆功能起關(guān)鍵作用，而C-末端的