幾種皮膚特異性表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因細胞鑒定.pdf

1、羊絨的生長十分復雜，受到環(huán)境和遺傳因素的共同影響，與毛囊的分化、形成、毛囊周期密切相關，這一過程受到一些抑制絨毛生長基因如FGF5，F(xiàn)GF18等的調(diào)控，同時也受到一些促絨毛生長基因如EGF，VEGF等的調(diào)控。在絨山羊育種領域，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源促絨毛生長基因轉(zhuǎn)入絨山羊體內(nèi)或者敲除抑制絨毛生長的特定基因，成為提高絨毛產(chǎn)量研究的熱點。
　　本研究包括兩部分的內(nèi)容，一是構(gòu)建皮膚特異性表達Cre重組酶基因載體，以應用于將來條件性敲除抑制

2、絨毛生長的基因;二是構(gòu)建含有多克隆位點的皮膚特異性表達功能基因的通用載體，為下一步構(gòu)建皮膚特異性表達促絨毛生長基因的載體提供條件。實驗首先采用PCR技術(shù)克隆皮膚特異性表達的人表皮角蛋白5啟動子(Hum keratin5 promoter，K5)和角蛋白14啟動子(Hum keratin14promoter, K14)及Cre重組酶基因，之后以pIRES2-EGFP-KAP6載體為基本骨架，通過重組連接，構(gòu)建了pIRES2-EGFP-KA

3、P6-Cre、pIRES2-EGFP-K5和pIRES2-EGFP-K14等3種皮膚特異性表達的載體;同時構(gòu)建了含CMV啟動子的pIRES2-EGFP-Cre非特異性表達載體;將pIRES2-EGFP-KAP6-Cre和pIRES2-EGFP-Cre兩種載體以LipofectamineTM2000介導，分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞和皮膚成纖維細胞，篩選轉(zhuǎn)基因細胞系并應用RT-PCR方法檢測外源基因的表達。
　　結(jié)果表明

4、，pIRES2-EGFP-KAP6-Cre、pIRES2-EGFP-K5和pIRES2-EGFP-K14等皮膚特異性表達載體和含CMV啟動子的pIRES2-EGFP-Cre非特異性載體構(gòu)建成功，載體測序正確，各元件按正確的順序連接。pIRES2-EGFP-KAP6-Cre，pIRES2-EGFP-Cre載體轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞和胎兒成纖維細胞，PCR結(jié)果顯示外源基因整合到了細胞基因組中。半定量RT-PCR檢測pIRES2-E