鯰愛德華氏菌自帶質(zhì)粒編碼的EseH、EseI和EscD在宿主細(xì)胞內(nèi)的分布與致病性研究.pdf

1、鯰愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）是一種兼性的胞內(nèi)寄生菌，為革蘭氏陰性，屬于腸桿菌科，可導(dǎo)致斑點叉尾鮰腸道敗血病，在我國可引起鯰形目魚類的疾病，如黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）頭部的“一點紅”或“頭穿孔”。
　　 本研究通過對分離自患病黃顙魚的鯰愛德華氏菌HSN-1株自帶的兩個質(zhì)粒pEI1和pEI2序列的測定，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白中有與Ⅲ型分泌系統(tǒng)(typeⅢ secretion s

2、ystem，T3SS)同源的分子。本研究對質(zhì)粒編碼的EseH、EseI和EscD進(jìn)行了在宿主細(xì)胞的定位及其致病性方面的研究。通過測序，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pEI1不含轉(zhuǎn)座子，其編碼的EseH和pEI2編碼的EscD和EseI分別與T3SS蛋白有一定程度的相似性，其中EseH和EscD分別具有T3SS超家族PRK15372和PRK15336的保守結(jié)構(gòu)域。而EseI在C-端與T3SS效應(yīng)分子OspB有較低程度的相似性，因此推測這3個蛋白可能與鯰愛德華氏

3、菌的致病性相關(guān)。由于pEI1和pEI2為多拷貝質(zhì)粒，本研究利用同源質(zhì)粒不相容原理對兩個質(zhì)粒分別進(jìn)行徹底消除以構(gòu)建目的基因缺失突變株，并檢測了突變株對黃顙魚的半數(shù)致死量(LD50)和體內(nèi)競爭感染系數(shù)(Competitive Index，CI)。野生型HSN-1的LD50為105.4775(R2=0.9945)，突變株ΔeseH和ΔeseI的LD50比野生型略高，分別為105.6567和105.8758，而ΔescD的LD50與HSN-1的

4、LD50差別較小，為105.5497。ΔeseH和ΔeseI的CI在肝臟分別為0.7246和0.6373，在脾臟為0.7044和0.6158，均顯著低于野生型(P＜0.01)，而ΔescD的CI則超過1.5，顯著高于野生型(P＜0.01)。用突變株感染鯉上皮瘤細(xì)胞(EPC)，發(fā)現(xiàn)ΔeseH，ΔeseI以及pEI1-pEI2-與野生型相比其對EPC的粘附力降低，而ΔeseI和pEI1-pEI2-的侵襲能力則明顯增強(qiáng)。比較突變株和野生型在黃

5、顙魚頭腎巨噬細(xì)胞的繁殖，發(fā)現(xiàn)ΔeseH的繁殖力降低，ΔeseI在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖受到抑制，最終被巨噬細(xì)胞清除，而ΔescD與HSN-1的差異不顯著(P＞0.05)。由于鯰愛德華氏菌與遲緩愛德華氏菌在T3SS的分子組成和基因排列方面都比較相似，本研究利用遲緩愛德華氏菌的T3SS檢測這3種蛋白是否由該系統(tǒng)所分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)EseH和EseI可被分泌并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)宿主細(xì)胞，EseH的分泌依賴轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的T3SS，而EseI則不依賴T3SS;被轉(zhuǎn)運(yùn)

6、進(jìn)入ZF4宿主細(xì)胞的EseH分布于細(xì)胞核外，定位于細(xì)胞的膜相，EseI定位于胞漿質(zhì)相;而EscD不被T3SS所分泌。此外，通過酵母雙雜交實驗，證明EscD與EseH或EseI不存在蛋白與蛋白之間的結(jié)合作用，即EscD不是所報道的EseH或EseI的分子伴侶。
　　 本研究對鯰愛德華氏菌HSN-1株質(zhì)粒pEI1和pEI2的基因組進(jìn)行了測序，通過構(gòu)建突變株發(fā)現(xiàn)eseH、eseI和escD皆為毒力基因，與細(xì)菌的粘附、侵襲及在魚類細(xì)胞或