豬弓形蟲體內(nèi)誘導抗原的鑒定及功能分析.pdf

1、弓形蟲(Toxoplasmagondii)是能夠感染真核細胞的頂器門寄生原蟲，呈世界性分布，宿主范圍廣，傳播途徑多樣，生活史復雜。可導致孕婦流產(chǎn)，新生兒先天性疾病，以及繼發(fā)免疫抑制患者致死性疾病。弓形蟲可致家畜流產(chǎn)和生長發(fā)育不良，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。通過攝食被弓形蟲污染的肉類可使人感染弓形蟲病。豬肉是人類主要的肉食來源之一，豬的弓形蟲感染嚴重威脅人類的生命健康。弄清弓形蟲的致病機理和開發(fā)安全有效的疫苗是預防和控制人類和動物弓形蟲

2、病的基礎和重要手段。
　　 為此，本研究構建了RH株弓形蟲速殖子cDNA表達文庫，利用體內(nèi)誘導抗原技術(IVIAT)，鑒定出14個豬弓形蟲體內(nèi)誘導抗原;利用實時熒光定量PCR(Real-timePCR)對其中5個抗原基因進行了體內(nèi)、外表達差異的驗證和體外原核表達;對弓形蟲鈣調(diào)蛋白(CaM)基因進行了RNA干擾(RNAi)，評價其表達下調(diào)對弓形蟲速殖子滑行運動、細胞粘附、入侵和溢出及胞內(nèi)繁殖等表型的影響;以弓形蟲體內(nèi)誘導抗原微線體

3、蛋白11(MIC11)α鏈構建了DNA疫苗，并在BALB/c鼠模型中檢測到保護性免疫應答的產(chǎn)生。
　　 (1)豬弓形蟲體內(nèi)誘導抗原基因的篩選與鑒定
　　 大量收集并純化RH株弓形蟲速殖子，提取總RNA，利用商業(yè)化SMARTTM技術構建以噬菌體為載體的cDNA表達文庫。構建的文庫重組率達到98％以上，初始文庫和擴增文庫滴度分別為2.1×106pfu/mL和1.6×109pfu/mL，文庫容量為3.2×1011個重組子?；旌?/p>

4、10份豬弓形蟲陽性血清并通過逐級吸附弓形蟲速殖子全細胞、超聲破碎裂解液和熱裂解物，去除血清中體外弓形蟲抗體。運用吸附后血清對表達文庫的3264個克隆進行免疫篩選，得到14個陽性克隆。對篩選得到的體內(nèi)誘導抗原進行EST序列分析和功能預測，14個抗原中包括涉及離子/蛋白結合、信號轉(zhuǎn)導、蛋白折疊、細胞入侵和生物合成與代謝等8個功能蛋白，同時包括6個未知功能的假定蛋白。
　　 (2)體內(nèi)誘導抗原體內(nèi)外表達差異的驗證及原核表達
　　

5、 選擇其中5個體內(nèi)誘導抗原基因，即CaM、致密顆粒蛋白5(GRA5)、MIC11、18KDa親環(huán)蛋白(C-18)和絲氨酸蛋白酶抑制劑(PI)，針對各自的ORF設計引物，real-timePCR檢測感染BALB/c鼠72h和在BHK細胞中培養(yǎng)72h的速殖子中，5個基因mRNA相對表達水平的差別。結果顯示，宿主體內(nèi)速殖子中5個基因mRNA表達量均高于體外培養(yǎng)速殖子中表達量，統(tǒng)計學分析差異顯著(p＜0.05)。其中CaM基因體內(nèi)、外mRNA

6、相對表達量差異最大，可達15.04倍。利用5個基因全長CDS序列設計原核表達引物，分別克隆各自ORF片段，連接原核表達載體pGEX-6p-1，形成重組GST融合表達質(zhì)粒。除pGEX-6p-1/GRA5表達失敗以外，其余4個重組質(zhì)粒均可在E.coliBL21系統(tǒng)中高效表達。分別利用弓形蟲陽性豬血清和商業(yè)化GST一抗血清對表達產(chǎn)物進行Western-blot分析，4個體內(nèi)誘導抗原均具有良好抗原性，且CaM和C-18抗原性較強。
　　

7、 (3)弓形蟲CaM的下調(diào)表達對速殖子表型的影響
　　 針對弓形蟲CaM基因序列不同位點設計3對siRNA(siRNA707，siRNA865，siRNA900)，對CaM的表達進行體外干擾。利用real-timePCR檢測轉(zhuǎn)錄水平干擾效果，結果顯示，3對siRNA對弓形蟲CaM的表達均有一定程度的干擾，對其他與弓形蟲CaM有同源性的基因無干擾作用，表明干擾特異性強，無脫靶效應。確定siRNA最優(yōu)作用時間為24h，最佳工作濃度為

8、200nmol/L。用鼠抗弓形蟲CaM多克隆抗體對干擾前后速殖子進行Western-blot，檢測蛋白質(zhì)水平干擾效果。三對siRNA中，siRNA900在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平上干擾效果最顯著。在BHK細胞模型中，觀察CaM被干擾后弓形蟲速殖子表型的變化。結果顯示，弓形蟲CaM的表達下調(diào)顯著降低速殖子的細胞粘附、入侵和溢出能力(p＜0.05)，但對其胞內(nèi)繁殖無影響(p＞0.05)。
　　 (4)體內(nèi)誘導抗原MIC11免疫原性的研究<

9、br>　　 將弓形蟲MIC11-α鏈基因片段與真核表達載體pcDNA3.1連接，構建DNA疫苗pcDNA3.1/MIC11。間接免疫熒光(IFA)證明重組質(zhì)粒在BHK細胞中可高效表達，并能被弓形蟲多克隆抗血清特異性識別。重組質(zhì)粒100μg免疫BALB/c小鼠，同時，設相同劑量pcDNA3.1空載體和100μLPBS陽性對照組。首次免疫后兩周，利用TLA-ELISA可在pcDNA3.1/MIC11免疫鼠血清中檢測到特異性TLA抗體，隨免

10、疫時間延長，抗體水平持續(xù)升高，對照組無抗體產(chǎn)生。細胞因子ELISA結果證明，構建的DNA疫苗可有效刺激機體產(chǎn)生高水平的IL-2、IL-12及IFN-γ，但對IL-4無刺激作用。淋巴細胞增殖實驗顯示，pcDNA3.1/MIC11免疫鼠淋巴細胞增殖水平顯著高于空載體組(p＜0.05)和PBS對照組(p＜0.05)。免疫后第8周，小鼠腹腔接種RH株弓形蟲速殖子，對照組小鼠在10天內(nèi)全部死亡，而疫苗組小鼠在攻蟲后15天仍有17％的存活率。以上結