黃萎病菌誘導(dǎo)下海島棉cDNA文庫構(gòu)建和抗病相關(guān)基因克隆.pdf

1、黃萎病(Verticillium wilt)是影響世界棉花生產(chǎn)的主要病害之一。育種實(shí)踐證明，培育抗病品種是控制棉花黃萎病的經(jīng)濟(jì)有效途徑。研究證明海島棉Pima90-53對(duì)黃萎病具有高度抗性;對(duì)其抗黃萎病相關(guān)基因進(jìn)行克隆研究不僅有利于闡明品種抗病機(jī)制，而且對(duì)棉花抗黃萎病的分子育種具有重要價(jià)值。本研究以海島棉Pima90-53為材料，構(gòu)建其在黃萎病菌誘導(dǎo)下的根系cDNA文庫，并依據(jù)文庫克隆棉花抗黃萎病相關(guān)基因。主要結(jié)果如下:
　　

2、1.構(gòu)建了黃萎病菌誘導(dǎo)下的海島棉Pima90-53根系的全長(zhǎng)cDNA文庫
　　 采用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了黃萎病菌誘導(dǎo)下的Pima90-53根系全長(zhǎng)cDNA文庫，該文庫基礎(chǔ)庫容量為1.28×106 PFU，重組率94％，擴(kuò)增后文庫滴度大于1010 PFU·mL-1，插入片段平均長(zhǎng)度1.1kb。經(jīng)隨機(jī)測(cè)序共獲得45條cDNA序列，利用Blastx程序進(jìn)行同源分析，4個(gè)contigs與假定抗病相關(guān)基因同源性較高;3個(gè)contigs

3、沒有注釋，可能為新基因。
　　 2.利用文庫篩選和RACE技術(shù)相結(jié)合，克隆了一個(gè)新的GbWRKY1基因
　　 利用構(gòu)建的cDNA文庫，結(jié)合RACE技術(shù)，獲得了一個(gè)新WRKY基因（GbWRKY1）(GenBank No.JF831361)。Gb WRKY1基因cDNA全長(zhǎng)1971bp，包括5'端非編碼區(qū)271bp，3'端非編碼區(qū)230bp，含有1個(gè)可能的polyA加尾信號(hào):AATAAT;基因開放閱讀框?yàn)?470bp，編碼一

4、個(gè)由489個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽。
　　 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GbWRKY1包括2高度保守的WRKY基本結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)，屬于WRKY家族第Ⅰ類，與VvWRKY2、AtWRKY4和AtWRKY3蛋白的同源性分別為62％、61％和59％; GbWRKY1屬可溶性蛋白，無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，包含N-糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、N端肉豆蔻酰化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、依賴cAMP和cGMP蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)等。
　　 Gb

5、 WRKY1基因含有3個(gè)內(nèi)含子，具有有保守的GT-AG剪切位點(diǎn)，分別為599 bp、81 bp、325 bp?？寺〉玫紾bWRKY1的1762bp啟動(dòng)子，包含植物病原誘導(dǎo)性啟動(dòng)子調(diào)控元件(RAV1AAT、Box-W1、ARE、W-box、CGTCA-motif、ERE、TGACG-motif)與非生物脅迫應(yīng)答元件(HSE、 TC-rich repeats、WRKY71OS、WBOXNTERF3、MYCATERD1)。
　　 構(gòu)建

6、了基因融合表達(dá)載體pCamE-GbWRKY1-GFP，基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化pCamE-GbWRKY1-GFP表皮細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)綠色熒光，GbWRKY1蛋白定位于細(xì)胞核。
　　 3.Northern雜交分析了GbWRKY1在黃萎病菌接種后的表達(dá)模式，揭示了基因與棉花抗黃萎病的聯(lián)系;實(shí)時(shí)定量PCR分析了GbWRKY1在不同激素處理下的表達(dá)模式，為解析基因作用機(jī)制提供了依據(jù);構(gòu)建了Gb WRKY1超表達(dá)與RNAi載

7、體，獲得了轉(zhuǎn)基因T3擬南芥
　　 Northern雜交分析Gb WRKY1表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，基因在Pima90-53的根、莖和葉組織均有表達(dá);在受黃萎病菌、SA、MeJA和ACC的誘導(dǎo)后呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。在黃萎病菌誘導(dǎo)后，Gb WRKY1基因在接種后出現(xiàn)持續(xù)高表達(dá)，在8h出現(xiàn)表達(dá)高峰，并持續(xù)高表達(dá)至接菌后12h。SA誘導(dǎo)后，其表達(dá)量在12h降到最低，24h基本恢復(fù)正常水平;MeJA誘導(dǎo)后，Gb WRKY1表達(dá)量上升，在12h達(dá)到高