家蠶Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)與功能鑒定.pdf

1、Hippo信號(hào)能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及凋亡進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)器官大小的調(diào)控。Hippo信號(hào)通路與人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。家蠶的Hippo信號(hào)通路方面的研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道，家蠶是典型模式經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，遺傳背景清晰，作為農(nóng)產(chǎn)品功能成分的營(yíng)養(yǎng)和安全評(píng)價(jià)的模式越來(lái)越受到重視。本研究以家蠶作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控及功能鑒定，對(duì)全面認(rèn)識(shí)Hippo信號(hào)通路的作用機(jī)制具有重要的意義，為進(jìn)一步把家蠶開(kāi)發(fā)成癌癥研究模型提供了理

2、論依據(jù)，為建立篩選具有治療癌癥作用的農(nóng)產(chǎn)品功能成分的模式動(dòng)物奠定了基礎(chǔ)。
　　利用定量PCR方法，研究了家蠶的Hippo信號(hào)通路的16個(gè)相關(guān)基因在不同組織中的表達(dá)。家蠶Hippo信號(hào)通路的16個(gè)基因中，13個(gè)基因主要在生殖腺和翅原基中表達(dá)，分別是Hippo、Sav、Wats、Mats、Kibra、Ex、Mer、Fat、Scribble、Dlg、aPKC、Par6和Yki基因；Lgl和下游SD基因主要在前胸腺中表達(dá)量高；Crb基因主

3、要在氣管叢和血淋巴中高表達(dá)。
　　調(diào)查了4齡2天到幼蟲(chóng)-蛹變態(tài)期1天（PP1）家蠶脂肪體中Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)模式，16個(gè)基因在4齡蛻皮階段和幼蟲(chóng)-蛹變態(tài)1天（PP1）均有表達(dá)高峰，2個(gè)高峰的水平取決于具體的基因。調(diào)查了4齡3天到幼蟲(chóng)-蛹變態(tài)期2天（PP2）家蠶翅原基中Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)模式，16個(gè)基因發(fā)育表達(dá)模式差別較大。5齡1天時(shí)，其中12基因的表達(dá)量最高；除下游應(yīng)答基因Yki外，其他15個(gè)基因在幼蟲(chóng)

4、-蛹變態(tài)期2天（PP2）表達(dá)量較低，Yki基因5齡5天后一直保持較高的表達(dá)量。
　　5齡2天的家蠶注射20E6小時(shí)后，脂肪體中Hippo通路相關(guān)的5個(gè)基因的表達(dá)變化趨勢(shì)不同。在所調(diào)查的基因中，Hippo和SD基因的表達(dá)量變化最大，分別提高7.8倍和4.2倍，其他3個(gè)基因表達(dá)量變化幅度不大或基本沒(méi)有變化。注射20E6小時(shí)后，翅原基中Crb、Scribble和Par6基因基因的表達(dá)量基本不變，Hippo、Mats、Fat、Dlg和Lg

5、l基因的表達(dá)量顯著上升，Kibra、Ex和Yki基因的表達(dá)量顯著下降，Wats、Mer、aPKC和Sav基因的表達(dá)量略微變化。
　　利用RNAi技術(shù)研究了抑制Yki、Hippo和USP表達(dá)后，調(diào)查家蠶表型的變化。對(duì)5齡7天的家蠶注射dsRNA，24小時(shí)后脂肪體中Hippo、Yki和USP基因的表達(dá)量分別下降了36.7%、12.9%和48.6%，翅原基中Hippo、Yki和USP基因的表達(dá)量分別下降了61%、21%、9.8%。家蠶Y

6、ki基因RNAi后前翅原基重量降低效果最明顯，前翅原基下降了將近27.5%，后翅原基降低了下降了6.1%；Hippo和USP基因RNAi后前后翅原基重量變化不大。直觀照片顯示注射Yki、Hippo和USP基因的dsRNA后家蠶的前翅原基均顯著減小，后翅原基變化不是很明顯，其中Yki基因的dsRNA后效果比Hippo和USP干擾對(duì)翅原基的發(fā)育影響更大。
　　利用病毒介導(dǎo)的超表達(dá)方法，調(diào)查Yki對(duì)家蠶表型的影響。轉(zhuǎn)染pFast-Yki

7、質(zhì)粒后，家蠶Bm12細(xì)胞Yki的mRNA表達(dá)水平上升了83倍。轉(zhuǎn)染Bac-Yki重組桿狀病毒載體4天后，脂肪體中Yki轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照上升了約3700倍，翅原基中Yki較對(duì)照上升了283倍。轉(zhuǎn)染Bac-Yki重組桿狀病毒載體4天后，家蠶前翅原基和后翅原基并沒(méi)有發(fā)生較大幅度的變化，重量也沒(méi)有明顯變化。這可能與Yki必須與其他蛋白因子共同作用才能調(diào)控家蠶翅原基的發(fā)育有關(guān)。
　　總之，本研究結(jié)果證明Hippo信號(hào)通路調(diào)控著家蠶器官的生長(zhǎng)發(fā)