番茄土傳病害拮抗菌的篩選、鑒定及其防病機理初探.pdf

1、番茄原產于南美洲，有較好的營養(yǎng)價值和經濟效益。近年來，設施番茄種植面積不斷擴大，高溫高濕的設施環(huán)境給各種病蟲害提供了有利的生長、繁殖條件，設施蔬菜病害頻繁暴發(fā)，而土傳病害（青枯病、枯萎病等）是影響設施番茄生產的主要病害。而使農產品產量大幅度降低，帶來嚴重的經濟損失。本文從寧夏、江蘇和福建等地的連作番茄、辣椒、西瓜等作物的根際土壤中分離、篩選出對番茄青枯病和枯萎病均有防治效果的拮抗細菌，對拮抗菌株的盆栽防效和田間防效測定，檢測其產生的抑菌

2、物質，對其進行種屬鑒定;并將防效最好的枯草芽孢桿菌PTS-394進行綠色熒光蛋白標記，以研究其在番茄根際土壤中的定殖動態(tài);同時也對PTS-394的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。主要結果如下:
　　(1)從寧夏銀川、江蘇沭陽和福建廈門的番茄、辣椒、西瓜等作物根際土壤中，分離純化獲得367個細菌分離物。以番茄枯萎病菌和番茄青枯病菌為靶標菌，從367株分離物中篩選出對兩種病菌皆具有很強拮抗作用的菌株22株。拮抗細菌抑菌物質的研究結果表

3、明:22株拮抗細菌均能分泌蛋白酶;不能分泌幾丁質酶;3株細菌能分泌纖維素酶;3株細菌能分泌嗜鐵素。盆栽實驗結果表明:拮抗細菌PTS-394對番茄枯萎病和青枯病的防效最高，分別為77.40％和80.00％;菌株H-70、L-1和SJ-280對番茄枯萎病和青枯病的防效均大于60％。對這四株拮抗細菌進行16srRNA種屬鑒定，均為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。
　　(2)選擇防效最好的菌株PTS-394，為研究其在番

4、茄根際土壤中的定殖規(guī)律，本實驗構建一標記菌株，即將同時攜帶綠色熒光蛋白基因和氯霉素抗性基因的重組質粒pGFP22以電擊轉入生防菌株PTS-394內，于含氯霉素平板上培養(yǎng)后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)光菌落，得到標記菌株PTS-GFP。對標記菌株進行生長速率和抑菌活性測定，測定結果表明，菌株進行綠色熒光蛋白基因標記對其生長沒有明顯影響，且室內抑菌實驗結果顯示，標記菌株對病原菌的抑菌活性與野生菌株沒有明顯差異。采用灌根法接種標記菌株，以稀釋分離法

5、和Real-TimePCR測定標記菌株PTS-GFP在番茄根際土壤的定殖動態(tài)。平皿稀釋法實驗結果表明，PTS-GFP在灌根0-15d時呈下降趨勢，15d后下降速度稍緩，至30d時可保持相對穩(wěn)定，約為6.5×104cfu/g，且RT-PCR法測得的定殖動態(tài)亦呈下降趨勢，此與稀釋分離法測得的結果一致。
　　(3)本實驗通過Plackett-Burman實驗設計及Box-Behnken設計的響應曲面法(responsesurfaceme

6、thodology，RSM)對影響生防菌株PTS-394發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。實驗結果表明，使PTS-394發(fā)酵菌含量和抑菌活性最大的成分關鍵因子的最優(yōu)配比為:玉米淀粉11.48g/L、黃豆粉13.35g/L、酵母膏0.60g/L。此時菌含量預測值為4.43×109cfu/mL，抑菌帶寬為6.20mm。以優(yōu)化的培養(yǎng)基為基礎，得到最優(yōu)培養(yǎng)條件組合為:培養(yǎng)溫度30.84℃、初始pH6.93和裝液量65.15mL/250mL時，