玉米Rubisco活化酶基因的克隆與表達分析.pdf

1、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，簡寫Rubisco)是葉片中含量最豐富的可溶性蛋白，其通過影響光合碳同化和光呼吸過程對光合作用產(chǎn)生明顯影響。但是該酶在植物體內(nèi)的催化效率很低，只有在Rubisco活化酶(RCA)存在時，才能保持較高的催化活性。RCA是一種核編碼葉綠體蛋白，廣泛存在于光合生物中，具有活化Rubisco的功能。RCA在調(diào)節(jié)植

2、物生長發(fā)育過程中起著重要作用，自在擬南芥中被報道以來，一直是農(nóng)業(yè)生物工程研究的焦點。
　　本研究運用生物信息學方法同源克隆玉米RCA基因;通過制備特異性抗體、Westernblot分析、MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析研究RCA基因的編碼機制;通過表達GFP融合蛋白的方法對玉米RCA進行亞細胞定位;通過實時熒光定量RT-PCR和半定量RT-PCR的方法分析RCA基因的表達模式;通過相關分析和回歸分析的方法明確RCA基因與產(chǎn)量之間

3、的關系。以上研究結(jié)果可以為玉米分子遺傳育種利用該基因提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：⑴基于玉米B73基因組序列同源克隆兩個RCA基因，其中一個為前人已報道基因Zmrca1，另一個為新發(fā)現(xiàn)的基因，暫命名為Zmrca3。其中Zmrca1的開放閱讀框(ORF)1299bp，編碼433個氨基酸，成熟蛋白包括381個氨基酸，分子量為42.70kD。新發(fā)現(xiàn)的Zmrca3基因開放閱讀框1389bp，編碼463個氨基酸，成熟蛋白包括411個氨基酸，分子

4、量為45.96kD。⑵通過體外原核表達和葉片體內(nèi)RCA蛋白表達試驗闡明RCA基因的編碼機制。對原核表達產(chǎn)物分析表明，Zmrca3和Zmrca1分別編碼兩個大小不同的蛋白，相應重組蛋白的分子量分別為52.8kD和50.1kD。玉米葉片RCA蛋白實驗表明，玉米葉片中存在兩個大小不同RCA亞基，其中Zmrca3基因編碼較大的多肽，Zmrca1基因編碼較小的多肽。⑶通過實時熒光定量RT-PCR和半定量RT-PCR的方法分析了Zmrca1和Zmr

5、ca3的表達特性。結(jié)果表明兩個RCA基因均具有組織表達特異性和生物鐘特性，其中在葉片中表達量最高，而在根中幾乎檢測不到;夜間兩基因的表達量逐漸增加，直至上午8:30表達水平最高，隨后逐漸下降，至夜間20:30表達水平最低。此外，兩基因在玉米抽穗期之前表達水平較低，灌漿期（授粉后第16-40天）表達水平相對較高。非生物脅迫分析表明，Zmrca1和Zmrca3的表達均受30℃高溫誘導。⑷通過TargetP1.1和WOLF PSORT對Zmr

6、ca1和Zmrca3所編碼的蛋白進行在線預測，結(jié)果表明RCA兩個蛋白主要定位在葉綠體上。亞細胞定位實驗也驗證了這一結(jié)果，當GFP單獨轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體時，GFP蛋白均勻分布在細胞質(zhì)中;當構(gòu)建的兩個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體時，融合蛋白分布在葉綠體中。⑸在123份具有廣泛遺傳變異的玉米自交系中，RCA基因相對表達量與單株產(chǎn)量相關分析表明，Zmrca1和Zmrca3相對表達量與單株產(chǎn)量分別呈極顯著和顯著正相關?；貧w分析表明，Zmrca1和Zmrca3兩