不同海洋生境來源微生物胞外多糖的結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究.pdf

1、海洋微生物所處的獨(dú)特生存環(huán)境，使其具有產(chǎn)生新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)和獨(dú)特生物學(xué)活性胞外多糖的潛質(zhì)，是開發(fā)海洋多糖類藥物的新資源。微生物胞外多糖作為天然活性生物大分子，在生物醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域日益受到人們的廣泛關(guān)注。本論文以十六種海洋來源的微生物發(fā)酵液為研究對(duì)象，提取胞外多糖并對(duì)其得率、理化性質(zhì)和單糖組成進(jìn)行分析，從中篩選得到五株海洋微生物，分別為珊瑚共生真菌Penicillium commune518＃；厚藤共生真菌Fusarium oxyspo

2、rum Y24-2；苔蘚共生真菌Penicillium purpurogenum ZZ05-4；紅樹林根泥真菌, Trichoderma.sp ghq-198和膠州灣海泥真菌Penicillium.sp ghq-18，對(duì)從中提取得到的胞外多糖進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化、結(jié)構(gòu)解析和抗氧化活性評(píng)價(jià)。研究結(jié)果如下：
　　1.十六種微生物胞外多糖的提取得率在0.43~3.56g/L之間；總糖含量在55.45％~92.30%之間；蛋白含量在0.8

3、2%~13.65%之間；所有胞外多糖中均沒有檢測(cè)到硫酸根的存在。在得到的十六種胞外多糖中，七種胞外多糖的單糖組成以甘露糖和葡萄糖為主，兩種以甘露糖和半乳糖為主，三種以相似比例的甘露糖、葡萄糖和半乳糖為主，另外編號(hào)為AH17-3和GW3-13的兩種微生物產(chǎn)胞外多糖還含有較高比例的葡萄糖醛酸和葡萄糖胺。分析表明，不同來源的微生物產(chǎn)胞外多糖在得率、單糖組成和理化性質(zhì)上均有較大差異。
　　2.從海南直針尖柳珊瑚Muricella abno

4、rmalis共生真菌Penicillium commune518＃發(fā)酵液中提取胞外多糖，經(jīng)過Q Sepharose Fast Flow陰離子柱層析和Superdex75 prep凝膠滲透色譜分離純化得到三個(gè)組分F1P-1S，F(xiàn)1P-2S和F1P-3S，其中主要組分F1P-2S的總糖含量約為96.4%，蛋白含量約為1.23%，分子量為18.6kDa，單糖組成主要由Man、Glc和Gal以27.9%、14.7%和57.4%的比例構(gòu)成。經(jīng)過I

5、R，甲基化和NMR分析表明，F(xiàn)1P-2S主要由→6)-β-D-Galf-(1→、→2)-β-D-Galf-(1→、→2,6)-α-D-Manp-(1→、→2)-α-D-Manp-(1→和α-D-Glcp-(1→以大約6:2:1:1:2比例構(gòu)成，其中主要以→2)-α-D-Manp-(1→作為主鏈，在O-6位存在一個(gè)以呋喃半乳糖為主的長(zhǎng)鏈分支的葡萄甘露半乳聚糖。體外抗氧化活性分析表明，F(xiàn)1P-2S具有良好的體外清除DPPH自由基活性，EC5

6、0為2.87 mg/mL。該結(jié)構(gòu)的胞外多糖是首次從珊瑚來源的真菌中分離得到的，對(duì)海洋微生物胞外多糖的研究具有重要意義。
　　3.厚藤共生真菌Fusarium oxysporumY24-2胞外多糖經(jīng)離子交換柱層析分離得到TW和TS兩個(gè)組分，得率分別為17%和36%；TS進(jìn)一步經(jīng)過Sephacryl S-100HR凝膠柱層析純化得到分子量大約為61.2kDa的純品胞外多糖TS-1。TS-1的總糖含量在91.3%左右，蛋白含量約為0.7

7、9%，主要由Man、Glc和Gal以1.33:1.30:1.00的比例構(gòu)成。甲基化、IR和NMR分析表明，TS-1主要由→6)-β-D-Galf-(1→為主要連接方式，并在每個(gè)呋喃半乳糖的C-2位存在分支，分支部分的結(jié)構(gòu)片段由β-D-Manp-(1→2)-β-D-Manp-(l→2)-α-D-Glcp-(1→、α-D-Glcp-(1→和β-D-Manp-(l→2)-α-D-Glcp-(1→以1:2:1的比例構(gòu)成，該類型的胞外多糖在海洋來

8、源Fusarium oxysporum中十分罕見。體外抗氧化活性分析表明，TS-1具有良好的體外清除DPPH自由基，羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力，特別是體外清除羥基自由基的能力為最好，其EC50值為1.15 mg/mL，可以作為一個(gè)抗氧化活性胞外多糖的新來源。為海洋共附生植物中結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特胞外多糖的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　4.苔蘚內(nèi)生真菌Penicillium purpurogenum ZZ05-4胞外多糖經(jīng)過陰離

9、子交換柱層析和凝膠滲透色譜分離純化得到兩種分子量分別為28.69kDa和43.91kDa的胞外多糖組分WHW-1和WHS-1。總糖含量和蛋白含量分別為90.30%~87.74%和2.69%~4.35%。甲基化、IR和NMR分析表明，WHW-1是由α-D-Manp-(1→、→2)-α-D-Manp-(1→和→2,6)-α-D-Manp-(1→殘基構(gòu)成的甘露聚糖，主要在→6)-α-D-Manp-(1→的C-2位存在分支結(jié)構(gòu)；WHS-1主要由

10、Man、Glc和Gal以4.20:1.30:0.02的比例構(gòu)成的中性雜多糖，部分酸水解后GC-MS分析表明，WHS-1主要由→2)-α-D-Manp-(1→構(gòu)成主鏈，末端Manp,和→2)-α-D-Manp-(1→構(gòu)成支鏈部分，在整個(gè)糖環(huán)結(jié)構(gòu)的最外圍部分連接有→5)-Galf-(1→和末端Galf殘基的結(jié)構(gòu)。該類結(jié)構(gòu)的胞外多糖在苔蘚來源的Penicillium purpurogenum中鮮見報(bào)道。
　　5.紅樹林根泥真菌Trich

11、oderma.sp ghq-198胞外多糖經(jīng)過離子交換柱層析分離得到水洗組分HQW和0.6M鹽洗組分HQS，得率分別為10.07%和45.42%。Superdex75 prep凝膠滲透純化獲得分子量分別為12.87kDa的HQW1和29.82kDa的HQS1。HQS1糖含量和蛋白含量分別為88.84%和3.49%。HQS1則主要由Man:Glc:Gal以5.92:0.87:3.98的比例構(gòu)成，HQS1經(jīng)甲基化分析發(fā)現(xiàn)連接方式非常復(fù)雜，共

12、存在非還原末端的Manp和Galf，→2)-Manp-(1→，→3)-Manp-(1→，→2)-Galf-(1→，→6)-Manp-(1→，→6)-Galf-(1→，→5,6)-Galf-(1→，→3)-Manp-(1→，→3,6)-Manp-(1→和→2,3,6)-Manp-(1→11種連接方式，部分酸水解后GC-MS分析表明，沉淀部分HQS1-P主要由→2)-Manp-(1→，→6)-Manp-(1→，→3)-Manp-(1→，→2

13、,6)-Manp-(1→及非還原末端Manp構(gòu)成。其中→6)-Manp-(1→和→2)-Manp-(1→的連接方式明顯增加，說明可這兩種連接方式構(gòu)成了多糖的主鏈結(jié)構(gòu)。對(duì)HQS1進(jìn)行了寡糖降解條件的摸索和制備，獲得聚合度為2~4含有取代甲基的寡糖片段。豐富了“海洋糖庫(kù)”中特征寡糖和多糖的結(jié)構(gòu)。體外氧化活性分析表明HQS1具有一定的體外清除DPPH自由基，羥基自由基和超陽(yáng)陰離子自由基活性。
　　6.膠州灣海泥真菌Penicillium

14、 sp. ghq-18胞外多糖經(jīng)過陰離子交換柱層析和凝膠柱色譜分離純化后主要得到四個(gè)多糖組分HW-1、HW-2、HS1-1和HS2-1。四者的得率分別為53.21%、9.22%、61.08%和37.59%；經(jīng)過HPGPC測(cè)定其分子量分別為16.9 kDa、11.3 kDa、20.7 kDa和26.6 kDa；主要組分HS1-1的單糖組成比例為Man:Glc:Gal=14.76:1.00:6.53，總糖含量為95.45%，還含有2.86%

15、的蛋白質(zhì)。IR，甲基化和 NMR分析表明 HS1-1是一個(gè)半乳甘露聚糖，甘露糖核心部分由→2)-α-Manp(1→、→6)-α-Manp(1→構(gòu)成主鏈，在1,2-連接甘露糖的C-3和C-6位存在α-Manp(1→分支；呋喃半乳糖部分是以β-(1→5)-Galf作主鏈，在O-6位存在非還原末端Galf的取代結(jié)構(gòu)。體外抗氧化活性測(cè)試表明HS1-1具有一定的體外清除DPPH，羥基自由基和超氧游離基的活性。該研究表明海洋基質(zhì)底泥來源真菌是活性胞