藻類(lèi)耐鹽基因的克隆及轉(zhuǎn)化棉花的初步研究.pdf

1、目前鹽堿地面積日益擴(kuò)大,改良和培育耐鹽堿的作物,有效開(kāi)發(fā)利用鹽堿地已成為世界性研究課題。棉花是典型的耐鹽堿的先鋒作物,但是目前生產(chǎn)上推廣的耐鹽棉花品種仍比較缺乏,挖掘耐鹽基因,通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良棉花的耐鹽能力,培育棉花耐鹽品種顯得尤為重要。
　　本研究以海帶(Laminaria japonica)配子體和杜氏鹽藻(Dunaliella salina)為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到兩個(gè)耐鹽相關(guān)基因完整序列信息,分別是海帶的

2、碳酸酐酶基因(CA)和杜氏鹽藻的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)。利用RT-PCR技術(shù)克隆了耐鹽相關(guān)基因的ORF全長(zhǎng),并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,利用綠色熒光蛋白(GFP)對(duì)其基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位,檢測(cè)了26種棉花材料花粉的自發(fā)綠色熒光現(xiàn)象,并利用基因槍進(jìn)行了花粉瞬時(shí)表達(dá)分析和大田棉花活體轉(zhuǎn)化,對(duì)收獲的T0代部分種子進(jìn)行了耐鹽性篩選和分子檢測(cè)。主要研究成果如下:
　　1.獲得兩個(gè)耐鹽相關(guān)基因完整ORF通過(guò)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)篩

3、選到兩個(gè)耐鹽相關(guān)基因(海帶和杜氏鹽藻各一個(gè)基因)完整序列信息,利用RT-PCR技術(shù)克隆了2個(gè)耐鹽相關(guān)基因的ORF全長(zhǎng),其中海帶CA基因完整開(kāi)放閱讀框873bp,編碼290個(gè)氨基酸。杜氏鹽藻GAPDH基因完整開(kāi)放閱讀框1131bp,編碼376個(gè)氨基酸。
　　2.生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析表明,CA基因編碼蛋白與杜氏鹽藻、水稻、苜蓿中華根瘤菌、大麻哈魚(yú)的相似性分別為89％、79%、78%、70%,系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示CA與杜氏鹽藻的進(jìn)

4、化距離最近。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,該蛋白由α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲組成。GAPDH基因編碼蛋白與擬南芥、蒺藜苜蓿、玉米和葡萄的同源性達(dá)到90%、92%、96%和97%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明,GAPDH與團(tuán)藻的進(jìn)化距離較近。
　　3.基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位構(gòu)建綠色熒光融合表達(dá)載體(pBI121-CA::GFP和pBI121-GAPDH::GFP),基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)CA基因編碼蛋白定位于細(xì)胞核膜上,GAPDH基因

5、編碼蛋白定位于細(xì)胞膜上。
　　4.棉花花粉瞬時(shí)表達(dá)分析首先檢測(cè)26種棉花花粉自發(fā)綠色熒光現(xiàn)象,其中23種自發(fā)綠色熒光強(qiáng)的材料被淘汰,三種自發(fā)綠色熒光弱的材料用基因槍活體轉(zhuǎn)化CA基因進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析,結(jié)果表明三種材料的綠色熒光均增強(qiáng),證明了便攜式基因槍活體轉(zhuǎn)化花粉獲得轉(zhuǎn)基因植株的可行性,并為下步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　5.基因槍活體轉(zhuǎn)化棉花構(gòu)建植物超表達(dá)載體(pBI121-CA和 pBI121-GAPDH),基因槍活體轉(zhuǎn)化大田抗蟲(chóng)

6、棉和非抗蟲(chóng)棉材料,收獲轉(zhuǎn)CA基因T0代棉桃41個(gè),成鈴率達(dá)13.1%,收獲轉(zhuǎn)GAPDH基因T0代棉桃348個(gè),成鈴率達(dá)16.9%。
　　6.收獲的T0代部分種子耐鹽性篩選采用雙夾層濾紙法,0.8%NaCl溶液進(jìn)行了耐鹽性檢測(cè),其中檢測(cè)162粒轉(zhuǎn)CA基因種子,發(fā)芽率達(dá)22.2%,檢測(cè)490粒轉(zhuǎn)GAPDH基因種子,發(fā)芽率達(dá)16.3%,對(duì)照組檢測(cè)120粒,發(fā)芽率為0.08%。
　　7.分子檢測(cè)
　　耐鹽性檢測(cè)后,發(fā)芽的和未發(fā)