雞LIF、POUV基因克隆、生物信息學(xué)分析及原核表達(dá).pdf

1、白血病抑制因子是白介素-6家族中的一種多效性細(xì)胞因子，可以多種方式作用于不同類型的細(xì)胞，其最顯著的作用是可以抑制胚胎干細(xì)胞的分化并保持其增殖能力。轉(zhuǎn)錄因子Oct4屬于POU家族中的第Ⅴ亞族，由POU5fl基因編碼，由未分化的胚胎干細(xì)胞表達(dá)，其表達(dá)水平?jīng)Q定了胚胎干細(xì)胞的分化方向。Oct4還是制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的關(guān)鍵因子。本研究的目的是克隆雞LIF、POUV基因、對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、構(gòu)建其原核表達(dá)載體并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)

2、1.以成年雞肝臟組織的總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出雞LIF基因，將其與pEASY-T1克隆載體連接，獲得重組質(zhì)粒pEASY-T1-chLIF，測(cè)序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，酶切重組質(zhì)粒pEASY-T1-chLIF，獲得正確克隆的雞LIF基因，將其與pET-30a原核表達(dá)載體連接，獲得重組質(zhì)粒pET-30a-chLIF。結(jié)果表明:(1)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEASY-T1-chLIF和pET-30a-chLIF;克隆的雞LIF基因全長(zhǎng)5

3、64bp，共編碼188個(gè)氨基酸，與GenBank上公布的Gallus LIF(XM_418264)相比，核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為99.8％、99.5％，無(wú)插入或缺失變異。(2)多物種LIF序列的比對(duì)結(jié)果表明，雞LIF與哺乳動(dòng)物的LIF保守性較低，LIF基因存在種屬特異性。(3)雞LIF蛋白理論分子量為20.885KDa，等電點(diǎn)為9.342。(4)雞LIF蛋白是親水性蛋白，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域。(5)雞LIF蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由48.6

4、6％的無(wú)規(guī)則卷曲、43.32％的α-螺旋和8.02％的伸展串組成，三級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)通過(guò)環(huán)連接的螺旋組成。
　　 實(shí)驗(yàn)2.實(shí)驗(yàn)方法基本同上，不同的是作為模板的總RNA是從新出殼的小公雞睪丸組織中提取的，使用的克隆載體是pMD18-T，最后獲得了重組質(zhì)粒pMD18-T-chPOUV和pET-30a-chPOUV。將重組質(zhì)粒pET-30a-chPOUV轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE和West

5、ren blot鑒定其表達(dá)的融合蛋白。結(jié)果表明:(1)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-chPOUV和pET-30a-chPOUV;克隆的雞POUV基因完整的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)888bp，共編碼295個(gè)氨基酸。與GenBank上公布的Gallus POUV(NM_001110178)相比，核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為99.4％、98.6％?？寺〉碾uPOUV基因全序列無(wú)插入或缺失變異。(2)多物種POUV序列的比對(duì)結(jié)果表明，POUV基因存

6、在種屬特異性，雞POUV與哺乳動(dòng)物的POUV有一段高度保守的氨基酸序列位于雞POUV的第83～227位氨基酸，可能是雞POUV蛋白的功能決定域。(3)雞POUV蛋白理論分子量為33.229KDa，等電點(diǎn)為9.791。(4)雞POUV蛋白是親水性蛋白，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列的N端沒(méi)有信號(hào)肽。(5)雞POUV蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由53.22％的無(wú)規(guī)則卷曲、33.56％的α-螺旋和13.22％的伸展串組成，三級(jí)結(jié)構(gòu)由兩個(gè)多螺旋結(jié)構(gòu)中間通過(guò)環(huán)連