豬DGAT1基因肌肉超表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠及克隆豬的檢測(cè)驗(yàn)證.pdf

1、豬肉是人類(lèi)攝取動(dòng)物蛋白的重要來(lái)源，優(yōu)質(zhì)豬肉細(xì)嫩多汁、口感豐富、肉色鮮紅，而肌內(nèi)脂肪(Intramuscularfat，IMF)含量與其有著極高的關(guān)聯(lián)，因此成為評(píng)定肉質(zhì)的重要指標(biāo)。人類(lèi)對(duì)豬的長(zhǎng)期遺傳選育投入了很大的人力和物力，更偏重于降低背膘厚度和提高瘦肉率，然而造成了肌內(nèi)脂肪含量的大幅下降，甚至高瘦肉型豬IMF含量降到了1.5％（建議范圍:2.5％-3％），導(dǎo)致豬肉品質(zhì)下降、口感變差，因此今后的選育方向轉(zhuǎn)變成在確保瘦肉率的同時(shí)增加IMF

2、含量。研究表明，肌內(nèi)脂肪含量的提高即意味著甘油三酯（triglycerol，TAG）含量的提高。DGAT1限速酶催化甘油三酯合成反應(yīng)的最后一步，在哺乳動(dòng)物的脂類(lèi)代謝中發(fā)揮著重要作用。因此，本研究以二?；视王；D(zhuǎn)移酶1作為候選基因，構(gòu)建了肌肉特異性真核表達(dá)載體sMCK-sDGAT，通過(guò)顯微注射和體細(xì)胞克隆分別獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬，以研究肌肉超表達(dá)DGAT1的效果和影響，為今后的研究提供材料并奠定基礎(chǔ)。取得的主要研究成果有:

3、　　 1、根據(jù)基因重組的原理，從豬MCK基因的細(xì)菌人工染色體中，獲得了MCK基因長(zhǎng)度為7261個(gè)堿基的啟動(dòng)子序列。以真核表達(dá)載體pEGFP-N1為框架去除GFP基因后，連接MCK基因啟動(dòng)子和人工合成的DGAT1基因全長(zhǎng)CDS，構(gòu)建肌肉特異性超表達(dá)DGAT1的真核表達(dá)載體sMCK-sDGAT1。采用PCR、酶切和測(cè)序的方式進(jìn)行鑒定，證明最終構(gòu)建的載體準(zhǔn)確無(wú)誤。
　　 2、通過(guò)顯微注射法將線性化sMCK-sDGAT1注射進(jìn)入小鼠受

4、精卵的雄原核，我們得到了16只陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因Founder鼠（委托上海南方模式生物科技有限公司），陽(yáng)性公鼠與陰性C57BL/6J母鼠交配后獲得F1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠。采用半定量檢測(cè)二月齡和四月齡小鼠的DGAT1基因表達(dá)量，進(jìn)行組織表達(dá)譜的研究，結(jié)果表明相較于陰性小鼠，DAGT1基因在陽(yáng)性小鼠的骨骼肌和腎臟內(nèi)高表達(dá)，在心肌內(nèi)中等表達(dá)，而在腦，肺，腸等組織內(nèi)很少表達(dá)。上述結(jié)果說(shuō)明MCK基因啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)DGAT1基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)，與對(duì)哺乳動(dòng)

5、物各個(gè)組織內(nèi)MCK基因表達(dá)的研究結(jié)果是一致的。
　　 3、我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了骨骼肌中參與脂肪合成和轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)部分基因的表達(dá)發(fā)生變化，如質(zhì)體乙酰輔酶羧化酶1(ACC1)的mRNA增加34％(p＜0.01)，脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP4）增加53％(p＜0.01)，脂肪酸合成酶(FAS)增加74％(p＜0.01)，乙烯前體ACC合成酶1(ACS1)增加62％(p＜0.01)，骨骼肌中的棕色脂肪特異基因UC

6、P1也增加了74％(p＜0.01)。WestenBlot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DGAT1、ACC1、FABP4和UCP1的蛋白水平也相應(yīng)的提高了。連續(xù)十周測(cè)定轉(zhuǎn)DGAT1陽(yáng)性小鼠與陰性小鼠的體重，數(shù)據(jù)顯示二者差異不顯著，說(shuō)明特異性增加IMF含量，并不會(huì)導(dǎo)致小鼠其它組織脂肪的過(guò)度沉積和肥胖。測(cè)定轉(zhuǎn)DGAT1陽(yáng)性小鼠骨骼肌中的甘油三酯和脂肪酸，發(fā)現(xiàn)二者相對(duì)于陰性小鼠分別增加了35.5％(p＜0.01)和20.3％(p＜0.01)。
　　

7、4、培養(yǎng)了豬30日齡胚胎的原代成纖維細(xì)胞系，用電擊轉(zhuǎn)染法將線性化的sMCK-sDGAT1片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)豬的成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選并進(jìn)行PCR檢測(cè)后獲得陽(yáng)性單克隆，作為體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞制備了轉(zhuǎn)基因豬。
　　 5、通過(guò)PCR及SouthernBlot檢測(cè)確定獲得了一頭原代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因豬，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)外源基因DGAT1基因的拷貝數(shù)，并通過(guò)計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式為L(zhǎng)og2N（拷貝數(shù)）=-0.