陸地棉AGL15同源基因cDNAs的克隆及功能驗證.pdf

1、棉花不僅是最重要的纖維作物，還是僅次于大豆的第二大油料作物和蛋白來源，是重要的世界性經濟作物，其栽培、生產和加工對世界政治和經濟起著深遠的影響。近年來，棉花的常規(guī)育種在提高棉花產量以及改善棉花纖維品質等方面取得了一定的進展。然而，由于受技術和種質資源的限制，在較短時間內實現(xiàn)棉花產量和纖維品質的大幅度同步提高，相對困難。棉花轉基因技術不受親緣關系制約，可以有目的、有計劃的將靶標基因導入植物基因組中，而且能夠在新背景條件下穩(wěn)定遺傳和表達，從

2、而實現(xiàn)優(yōu)良基因共享、打破基因連鎖、定向改造植物遺傳特性以及縮短育種時間等目標，為棉花的科學技術研究帶來了新的曙光。棉花轉基因技術以植物體細胞胚胎發(fā)生為基礎，進行棉花體細胞胚胎發(fā)生機理的細胞學以及分子生物學相關研究就顯得尤為重要。
　　 MADS-box基因家族編碼一類特異性轉錄因子，它們在植物發(fā)育的諸多過程中均發(fā)揮著非常重要的作用。該家族基因編碼的蛋白質N末端均具備一個高度保守的DNA結合結構域，約60個氨基酸大小。AGL15是

3、MADS-box基因家族中的一個亞家族成員，研究表明該家族基因在植物體細胞胚胎發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，不過，在棉花中的研究尚未見報道。本研究利用同源克隆技術從陸地棉中克隆獲得4個AGL15家族基因，主要研究結果如下:
　　 1.陸地棉GhAGL15基因的克隆及生物信息學分析
　　 利用擬南芥AtAGL15氨基酸序列進行同源比對，以陸地棉CCRI cDNA為模板，進而通過PCR擴增獲得目的基因。對得到的四個目的基因序列分

4、別進行生物信息學分析，主要包括序列分析、多重序列比對以及進化樹構建等。結果表明它們均屬于A GL15亞家族成員，并分別命名為GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和GhAGL15-4。
　　 2.陸地棉GhAGL15轉錄因子的亞細胞定位分析
　　 將目的基因GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和GhAGL15-4分別構建35S-GhAGL15-GFP瞬時表達載體，采用農桿菌介導法

5、將融合表達載體轉化到洋蔥表皮細胞，進行顯微觀察。綠色熒光蛋白信號在細胞內的分布情況表明它們均定位子細胞核。
　　 3.陸地棉GhAGL15基因的表達模式分析
　　 熒光定量結果表明，在非胚性器官（根、莖、幼葉和花瓣）中，GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和GhAGL15-4基因在莖和葉中的表達量極低;然而在花瓣中均具有較高的表達量。GhAGL15-2是唯一在根中具有較高表達量的基因，GhAGL15

6、-1、GhAGL15-3和GhAGL15-4在根中的表達量均非常低。在體細胞胚胎發(fā)生過程中，GhAGL15-1基因在胚性愈傷組織中的表達量最高;GhAGL15-2基因在愈傷組織中的表達量相對較低，表達量在胚性愈傷組織發(fā)育階段持續(xù)增加，在胚性愈傷組織發(fā)育的后期達到峰值。GhAGL15-3和GhAGL15-4基因的表達水平穩(wěn)定增加，在胚性愈傷組織發(fā)育后期達到最高后呈現(xiàn)下降趨勢。GhAGL15-1、GhAGL15-2、GhAGL15-3和Gh

7、A GL15-4在胚狀體四個時期（球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚）的表達量均表現(xiàn)出最低，有的甚至很難檢測出表達量的存在。
　　 4.陸地棉GhAGL15-3基因啟動子的克隆及生物信息學分析
　　 采用同源克隆方法，克隆得到GhAGL15-3基因啟動子序列，其長為1232bp。分析可能存在的基礎啟動子區(qū)域有兩處。預測TSS在第1047bp處的T。含有分生組織表達響應元件、生長素響應元件、赤霉素響應元件以及干旱脅迫響應元