預苯丙酸脫氫酶(PDH)基因?qū)η嗷ú诉z傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、維生素E（Vitamin E）是一種脂溶性維生素，又稱生育酚，主要具有促進生殖、抗氧化、防止細胞衰老、改善脂質(zhì)代謝和血液循環(huán)、加速傷口愈合等作用。然而在自然條件下，維生素E只能在植物和某些光合細菌體內(nèi)的合成，人體只能從膳食中獲取。蔬菜是人們?nèi)粘Ｉ钪凶钪匾母笔称?，因此，通過生物技術的手段增加蔬菜中維生素E的含量成為必然。研究表明，在莽草酸途徑合成維生素E的全過程中，PDH（預苯丙酸脫氫酶）是代謝途徑中一個起重要作用的關鍵酶。而HPPD

2、（羥基苯基丙酮酸雙氧化酶）是對羥苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化為尿黑酸的過程的一個關鍵酶類，同時也是三酮類等環(huán)境友好型除草劑的靶位點。HPPD的作用底物HPP（羥基苯基丙酮酸）是尿黑酸形成中質(zhì)體醌與維生素E生物合成中的關鍵前體物質(zhì)。
　　本研究，通過生物技術的方法構建雙元表達載體pCAMBIA3300-35S-PDH-Tnos-35S-HPPD-Tnos轉(zhuǎn)化具有營養(yǎng)保健功能的蔬菜——青花菜。主要工作成果如下：
　　1、提取釀酒酵母（Sacc

3、haromyces cerevisiae）INVSC1的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI上已登錄的PDH基因序列設計引物，克隆獲得PDH基因片段。檢測結果顯示：所克隆的基因序列與Gene Bank中公布的序列相似度為99.6%。
　　2、提取小擬南芥（Arabidopsis pumila）的總DNA，根據(jù)NCBI上已登錄的擬南芥HPPD基因序列設計引物（目前沒有小擬南芥HPPD基因的報道），克隆獲得HPPD基因片段。檢測結

4、果顯示：所克隆的基因序列與Gene Bank中公布的序列相似度為92.60%。
　　3、構建植物雙元表達載體pCAMBIA3300-35S-PDH-Tnos-35S-HPPD-Tnos轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，轉(zhuǎn)化青花菜（Brassica oleracea var.italica），其中HPPD基因取代原有的bar基因做為除草劑抗性標記基因，大大簡化了后期遺傳轉(zhuǎn)化的工作量，這也是本試驗的一個創(chuàng)新點。經(jīng)過PCR和除草劑抗性試