馬鈴薯甲蟲保幼激素合成與信號轉(zhuǎn)導相關基因的克隆和功能分析.pdf

1、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)是北美洲、歐洲和亞洲的大部分國家馬鈴薯上最重要的食葉害蟲，也是我國對外重大檢疫對象和重要外來入侵物種。嚴重發(fā)生時可致使馬鈴薯減產(chǎn)一半以上，甚至絕收。長期的農(nóng)藥防治使馬鈴薯甲蟲的抗藥性日漸增強，急需研究和開發(fā)新的防治技術?；蚋蓴_(RNAi)作為新的科學研究手段，不僅可以用于基因功能的研究，還可以通過轉(zhuǎn)基因的方式轉(zhuǎn)入植物或者工程菌內(nèi)，這為害蟲防治提供了新的思路。保幼激素是調(diào)節(jié)

2、昆蟲生長發(fā)育的重要激素，而且只在昆蟲等生物內(nèi)存在。因此，研究保幼激素相關基因功能對昆蟲生長發(fā)育的研究及害蟲治理新措施的開發(fā)都具有重大意義。
　　本文克隆了9個馬鈴薯甲蟲保幼激素合成及信號轉(zhuǎn)導途徑相關基因的全長cDNA序列，并采用RNA干擾方法研究了3個合成相關基因被抑制后對幼蟲的影響，確定這些基因是否能成為RNAi防治害蟲的潛在靶基因。現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　1、馬鈴薯甲蟲保幼激素合成相關基因的克隆
　　根據(jù)家蠶和

3、赤擬谷盜等基因組中已經(jīng)公布的相關基因的信息，從馬鈴薯甲蟲轉(zhuǎn)錄組中，獲得了3條保幼激素合成相關基因片段，它們分別是:保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶、法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶腺苷高半胱氨酸水解酶。通過常規(guī)PCR，驗證了這些基因片段的真實性，進而利用RACE技術，克隆出了這些基因的全長序列。通過氨基酸序列多重比對，發(fā)現(xiàn)這些基因與其他物種均有較高的相似性。同時，應用qPCR技術，測得了3個保幼激素合成相關基因不同發(fā)育期的相對表達量。這些基因的mRNA水平與馬鈴薯

4、甲蟲中保幼激素滴度變化基本一致。
　　2、馬鈴薯甲蟲保幼激素合成相關基因的RNA干擾效應
　　通過大腸桿菌表達dsRNA的方法，對保幼激素合成途徑中的保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶、法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶和腺苷高半胱氨酸水解酶3個基因進行了RNA干擾實驗。結(jié)果表明，喂食保幼激素合成相關基因dsRNA之后，幼蟲體內(nèi)3個靶基因的表達量均顯著下降。基因沉默使部分試蟲死亡，部分幼蟲表型異常，化蛹和羽化均受阻。保幼激素類似物吡丙醚可以部分補償合成酶相

5、關基因沉默產(chǎn)生的不利影響。
　　3、馬鈴薯甲蟲JH信號轉(zhuǎn)導相關基因的克隆及干擾JH代謝基因?qū)ζ浔磉_的影響
　　獲得了6個保幼激素信號轉(zhuǎn)導途徑相關基因全長cDNA，它們分別是:核受體轉(zhuǎn)錄激活因子2、Kruppel-homolog 1、烯蟲酯耐受蛋白和Broad家族3個基因。攝入保幼激素合成相關基因dsRNA之后，部分保幼激素信號轉(zhuǎn)導途徑相關基因的表達量也有不同程度下調(diào)。而保幼激素類似物吡丙醚可以部分恢復轉(zhuǎn)導途徑相關基因的表達。