小麥赤霉病抗性機(jī)制的代謝圖譜分析.pdf

1、小麥赤霉病是由鐮刀菌引起的一種世界性的真菌病害，主要在濕潤和半濕潤地區(qū)發(fā)生。有17種鐮刀菌可以誘發(fā)該病的發(fā)生，其中F.graminearum是流行最廣、危害最大的一種。赤霉病不僅會(huì)造成作物的毀滅性減產(chǎn)，還會(huì)降低籽粒品質(zhì)。更為糟糕的是，F(xiàn).graminearum可以分泌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等真菌毒素，使人畜食用后中毒。宿主抗性是控制這一病害的最安全、有效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法。目前小麥抗赤霉病的分子機(jī)制尚不明確。因此，本研究以含有抗赤霉病基因F

2、hb1的抗病近等基因系(Near-IsogenicLine-Resistant，NIL-R)和不含抗赤霉病基因Fhb1的感病近等基因系(Near-IsogenicLine-Susceptible，NIL-S)為材料，利用全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Comprehensivetwo-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry,GC×GC-TOF MS)對(duì)

3、接種F.graminearum后0、6、12、24、48、72和96小時(shí)(Hours post inoculation，hpi)的小麥穎殼代謝圖譜進(jìn)行比較分析，從代謝物水平探討小麥赤霉病抗性機(jī)制。同時(shí)，用spike-in試驗(yàn)對(duì)小麥代謝物分離、檢測(cè)平臺(tái)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺(tái)的可行性，以及儀器檢測(cè)到的豐度變化(Fold-change，F(xiàn)C)與實(shí)際濃度變化之間的關(guān)系進(jìn)行分析。主要結(jié)果如下:
　　1.GC×GC-TOF MS可用于小麥代謝

4、物的分離、檢測(cè)。小麥代謝物中氨基酸類物質(zhì)最多、含量最高。這些物質(zhì)在一維方向無拖尾現(xiàn)象，在二維方向略有拖尾，但三維檢測(cè)顯示峰型正常;spike-in試驗(yàn)中，在加入的27種酸中，25種可以被檢測(cè)到，而且23種酸在所有重復(fù)中均存在;90％代謝物的一維和二維時(shí)間的RSD值小于5％，幾乎100％代謝物一維和二維時(shí)間的RSD值小于10％。在p=0.05水平時(shí)，TPR、PPV（精確度）和F1（準(zhǔn)確度）在各濃度組合中的最大值分別達(dá)0.58、0.60和0

5、.78。相對(duì)較高的F1值和適中的TPR和PPV值表明數(shù)據(jù)處理平臺(tái)可用于小麥代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。
　　2.本研究將鑒定到的216個(gè)代謝物分為8個(gè)化學(xué)組和13個(gè)生物組，其中次生代謝物代謝(secondary metabolites metabolism)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)是最主要的2個(gè)生物組，而氨基酸(amino acid)和有機(jī)酸(organic acid)則是最重要的2個(gè)化學(xué)組，多數(shù)氨基

6、酸和有機(jī)酸均參與次生代謝物代謝和氨基酸代謝。由此可知，次生代謝物代謝和氨基酸代謝在F.graminearum侵染過程中發(fā)揮重要作用。聚類分析和主成分分析顯示，F(xiàn).graminearum侵染的前96 h可以明顯分為4組:0hpi一組，6-24 hpi一組，48hpi為單獨(dú)的一組，最后一組是72-96 hpi，即侵染過程可以分為5個(gè)階段:0-6hpi是一個(gè)階段，6-24 hpi是第二階段，24-48 hpi是第三階段，48-72是第四階段，

7、而72-96 hpi是第五階段。這與前人對(duì)禾谷鐮刀菌侵染過程的觀察結(jié)果相吻合。
　　3.Statistical t-test中p＜0.05或FC＞1.32的代謝物被視為顯著差異代謝物。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)共檢測(cè)到165個(gè)顯著差異代謝物（不考慮時(shí)間點(diǎn)的影響），這些顯著差異代謝物主要屬于氨基酸、有機(jī)酸、醇、脂肪酸和芳香酸類物質(zhì)。檢測(cè)到的顯著差異代謝物因時(shí)間點(diǎn)的不同而異:在0、6、12、24、48、72和96 hpi分別檢測(cè)到53、61、58、7

8、3、57、64和41個(gè)顯著差異代謝物。有18個(gè)顯著差異代謝物至少在連續(xù)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)，被視為抗病相關(guān)代謝物(Resistance-related metabolites，RRMs)。此外，羥基己酸(Hydroxycaproic acid)、辛二酸(Octanedioic acid)、6-十四醇(6-Tetradecanol)、異丁二酸(Methymalomic acid)和環(huán)氧丙烷(Methyloxirane)幾乎僅在某一近等基因系中檢

9、測(cè)到，因此這5個(gè)代謝物也被視作RRMs，即共檢測(cè)到23個(gè)RRMs。
　　4.Pearson相關(guān)性分析共檢測(cè)到2111對(duì)顯著相關(guān)代謝物(540對(duì)代謝物顯著負(fù)相關(guān)，1571對(duì)代謝物顯著正相關(guān))，在KEGG數(shù)據(jù)庫中匹配到95條代謝途徑。根據(jù)代謝物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)和KEGG數(shù)據(jù)庫中匹配到的代謝途徑的整合，構(gòu)建小麥赤霉病抗性相關(guān)微衛(wèi)星代謝網(wǎng)絡(luò)。主要包括茉莉酸(Jasmonic aicd，JA)合成途徑、乙烯(Ethylene，ET)合成途徑

10、、生長素(Auxin)合成途徑、水楊酸(Salicylic acid，SA)合成途徑、腐胺(Putrescine)合成途徑、木質(zhì)素(Lignin)合成途徑和角質(zhì)(Cutin)合成途徑，其相應(yīng)合成前體或合成單體表現(xiàn)如下:
　　1)角質(zhì)合成單體stearate和腐胺合成前體ornithine的變化趨勢(shì)一致:在12-48 hpi，NIL-R中stearate和ornithine的豐度顯著高于NIL-S(p＜0.05)，在24-48 hp

11、i，NIL-R和NIL-S之間存在明顯不同的變化趨勢(shì)，即NIL-R呈下降趨勢(shì)，而NIL-S中上升趨勢(shì)。由此可知，cutin和putrescine在12-48 hpi階段起抗性作用。
　　2)在24-48 hpi之間，auxin合成前體trytophan在NIL-R和NIL-S中均呈下降趨勢(shì)，NIL-R中的豐度顯著高于NIL-S(p＜0.05);并且，在此階段中，SA合成前體benzoic acid在NIL-R中的消耗量要高于NIL

12、-S;與NIL-S相比，NIL-R在6-12hpi階段含有更高豐度的linolenic acid;48-72 hpi，linolenic acid在NIL-R中的消耗量要顯著高于NIL-S。即auxin和SA在24-48 hpi階段發(fā)揮抗性作用，而JA則在6-12hpi和48-72 hpi兩個(gè)階段發(fā)揮抗性作用。
　　3)木質(zhì)素合成前體p-coumaric acid和ET合成前體methionine在NIL-R和NIL-S中均呈上升

13、趨勢(shì)，NIL-R和NIL-S之間無顯著差異，說明小麥穎殼的木質(zhì)化和ET為基本防御反應(yīng)，與抗性反應(yīng)無關(guān)。
　　5.小麥-F.graminearum之間的互作是涉及多個(gè)分子事件的復(fù)雜過程。從48 hpi處可以將F.graminearum早期侵染過程分成兩個(gè)時(shí)期。前48 hpi是F.graminearum的營養(yǎng)型侵染階段。在這一時(shí)期，首先是JA合成用于識(shí)別病菌的侵染，作為信號(hào)物質(zhì)激活cutin的加厚，阻止F.graminearum菌絲的

14、侵染。當(dāng)F.graminearum菌絲透過cutin侵入內(nèi)部時(shí)，putrescine和SA被順序激活形成HR和局部SAR,從而抑制病菌在侵染小穗中的生長和蔓延。此外，SA還可形成長距離SAR:SA先合成甲基水楊酸(Methyl salicylicacid，MeSA)，隨后MeSA作為信號(hào)物質(zhì)被傳遞到未侵染小穗，然后水楊酸結(jié)合蛋白2將MeSA分解成SA，從而在未侵染小穗形成SAR，阻止病菌在穗部擴(kuò)展。HR導(dǎo)致的細(xì)胞死亡利于半腐生型真菌F.

15、graminearum的生長。因此，auxin在24-48 hpi被激活，逆轉(zhuǎn)后期的HR,抑制HR在侵染小穗中過度蔓延，同時(shí)形成局部SAR抑制病菌擴(kuò)展。48 hpi之后，Auxin激活JA的合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞死亡和病菌生長（第二階段）。JA與脂類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合被轉(zhuǎn)運(yùn)至未侵染小穗形成長距離SAR,與第一階段SA形成的SAR結(jié)合，阻止病菌在穗部擴(kuò)展。此外，JA可以形成可揮發(fā)的甲基茉莉酸，通過空氣傳播使未侵染穗子形成抗性反應(yīng)?？傊?，多個(gè)分子事件