致犢牛肺炎和關(guān)節(jié)炎牛支原體診斷方法的建立.pdf

1、牛支原體(Mycoplasma bovis,M.bovis)是一種可導(dǎo)致牛發(fā)生肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎甚至流產(chǎn)與不孕等多種疾病的重要致病性病原體,在環(huán)境等其他應(yīng)激因素的作用下還可引起多種疾病的繼發(fā)感染。自1961年Hale在美國首次從患乳腺炎的牛乳中分離到該病原后,其他國家也相繼發(fā)現(xiàn)并暴發(fā)了由該病原引起的牛支原體病,我國自2008年開始以湖北省為首的不同地區(qū)也相繼暴發(fā)了牛支原體疫情,目前該病在世界范圍內(nèi)廣泛存在,

2、發(fā)病率和死亡率較高,每年因該病給世界養(yǎng)牛業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失巨大,嚴(yán)重影響和制約著各國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。因此,建立快速準(zhǔn)確的檢測方法對于該病的診斷和防治有重要意義。
　　本研究在牛支原體新疆分離株分離鑒定完成的基礎(chǔ)上,分別從病原學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)角度出發(fā)建立了三種不同的快速檢測方法,以期更加全面、準(zhǔn)確地對該病作出診斷。本論文的研究結(jié)論如下:
　　1.M.bovis間接免疫酶標(biāo)組織化學(xué)方法的建立。分別以雞抗M.bovis IgY、

3、羊抗雞IgG-HRP為一抗和二抗,對牛支原體菌體涂片、牛支原體陽性肺組織切片進(jìn)行免疫組化染色,通過條件優(yōu)化,建立了M.bovis間接免疫組化檢測方法,用該方法對病死犢牛病料進(jìn)行檢測,并以細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證,檢測結(jié)果與分離培養(yǎng)和PCR結(jié)果一致,具有特異性和可靠性。
　　2.M.bovis間接ELISA檢測方法的建立。以M.bovis全菌體蛋白經(jīng)超聲波裂解后的裂解物作為包被用抗原,通過棋盤滴定法確定抗原的最適包被濃度為2

4、00ug/mL,待檢血清最佳稀釋度為1:100,同時(shí)對抗原的包被方式、酶標(biāo)二抗最佳工作濃度、一抗和二抗最佳作用時(shí)間等進(jìn)行了優(yōu)化,建立了檢測M.bovis血清抗體的間接ELISA方法,用該方法檢測牛布魯氏菌病、牛病毒性腹瀉粘膜病抗血清均無交叉反應(yīng),表明該間接ELISA具有很好的特異性。
　　3.基于牛支原體P81基因環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的建立及與巢式PCR靈敏度的比較。根據(jù)GeneBank中登錄的M.bovis P81基因序列設(shè)計(jì)特異