低氮脅迫下黃瓜幼苗差異表達(dá)基因鑒定與蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L.)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黃瓜栽培上需要施用大量的肥料，尤其是氮肥。氮肥是植物最重要的礦質(zhì)元素，它是氨基酸、蛋白質(zhì)、葉綠素、核酸、脂類(lèi)以及其他重要代謝物質(zhì)的組成成分。氮素的缺乏會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)減慢，加速衰老，最終影響經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。然而，大量施用氮肥不僅增加的生產(chǎn)成本，還會(huì)導(dǎo)致果實(shí)硝酸鹽過(guò)量積累和產(chǎn)生土壤鹽漬化。減少肥料的投入的同時(shí)提高產(chǎn)品質(zhì)量而不影響產(chǎn)量是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)面臨的主要挑戰(zhàn)。在前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2、中，我們發(fā)現(xiàn)一些栽培品種對(duì)低氮脅迫有著較好的耐性。
　　 本研究選用前期試驗(yàn)中鑒定出的耐低氮品種“津研四號(hào)”，通過(guò)其在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異，研究其在低氮脅迫條件下的應(yīng)答機(jī)制，希望能為揭示黃瓜耐低氮脅迫的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　 為了鑒定黃瓜轉(zhuǎn)錄水平對(duì)低氮脅迫的應(yīng)答，本試驗(yàn)分別在正常營(yíng)養(yǎng)條件以及低氮條件下栽培該黃瓜品種，并選取幼苗葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的差異比較。通過(guò)Solexa測(cè)序技術(shù)，本試驗(yàn)鑒定出868個(gè)響應(yīng)低氮脅迫的

3、基因，其中654個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，214個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄因子、酶基因以及與激素調(diào)節(jié)相關(guān)的基因等。本試驗(yàn)選取了20個(gè)氮代謝相關(guān)或差異顯著的基因進(jìn)行驗(yàn)證，其中19個(gè)基因與表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果一致，達(dá)到95％，證明表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。為了進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，本試驗(yàn)選取了已驗(yàn)證的15差異基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果與RT-PCR結(jié)果完全一致，進(jìn)一步證明了表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果的可靠性。GO分析結(jié)果

4、顯示差異表達(dá)基因主要涉及“代謝過(guò)程”，“細(xì)胞”，“結(jié)合”，“細(xì)胞過(guò)程”，“細(xì)胞器”以及“催化活性”等。其中，在“含氮化合物代謝過(guò)程”中含有62個(gè)差異表達(dá)基因，其中44個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，18個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。本試驗(yàn)同時(shí)鑒定出了一些富集的Pathway，例如光合作用捕光蛋白質(zhì)，苯基丙酸類(lèi)合成，類(lèi)黃酮的生物合成、氮代謝、光合作用以及苯丙氨酸代謝等途徑。
　　 為了鑒定低氮脅迫下黃瓜幼苗蛋白質(zhì)水平的變化差異，本試驗(yàn)選取與Solexa測(cè)序相同

5、的材料進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳分析。用24cm，pH4-7的IPG膠條進(jìn)行試驗(yàn)，每根膠條上樣量為1mg，用12.5%的分離膠進(jìn)行雙向電泳。對(duì)照與低氮處理各進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色后的膠，用掃描儀在300dpi分辨率采集圖像。用Imagemaster2D Platinum7.0圖像分析軟件處理圖像，分析差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，并進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果表明：在低氮脅迫處理下，表達(dá)出現(xiàn)明顯差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)共有7個(gè)。通過(guò)質(zhì)譜分析，對(duì)這7個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行