柔嫩艾美耳球蟲AHFX株的鑒定及其對雞血清生化指標(biāo)的影響.pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳屬的一種或多種球蟲寄生于雞腸道上皮細(xì)胞內(nèi)而引起的呈世界性分布的原蟲病,該病對養(yǎng)雞業(yè)危害十分嚴(yán)重。本試驗選用玻璃紙膠囊單卵囊分離技術(shù)成功分離到一株球蟲,并應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行了鑒定,最終鑒定為柔嫩艾美耳球蟲安徽肥西(AHFX)株;用所獲球蟲感染雛雞,對雛雞感染后不同階段血清生化指標(biāo)的變化進(jìn)行了研究。
　　首先,從安徽肥西縣某雞場選擇具有盲腸球蟲病典型癥狀的病雞,取病雞盲腸內(nèi)容物研碎后加生理鹽水?dāng)嚢杌靹?經(jīng)

2、40目銅絲篩和260目尼龍篩過濾,濾液經(jīng)3000r/min,離心10min,收集沉淀。向沉淀物中加入適量2.5％重鉻酸鉀,置于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)至85%以上卵囊孢子化,孢子化卵囊于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ圆ＡЪ垶檩d體,配合使用空膠囊進(jìn)行球蟲單卵囊分離,先將卵囊液稀釋至每滴卵囊液中只含有1~2個卵囊,沾取一滴置于0.5cm×0.5cm的玻璃紙上,觀察卵囊的形態(tài)學(xué)特征,而后置于空膠囊內(nèi),經(jīng)口接種于20只6d齡雛雞,接種后第5d開始檢查糞樣中卵囊

3、,以判斷雛雞球蟲感染情況。
　　隨后,將上述單卵囊分離所獲后代球蟲(第一代),按1×104個卵囊/雞的劑量感染14d齡無球蟲雛雞,每日觀察雞只精神狀態(tài),食欲狀況,糞便變化。在喂服115h后,每2h檢查1次糞便,并記錄最早出現(xiàn)卵囊的時間即最短潛在期,同時用沉浮法收集球蟲卵囊(第二代),測定最短孢子化時間。分別隨機(jī)測量50個第一代與第二代球蟲卵囊,并對其大小進(jìn)行差異顯著性檢驗(F檢驗)。
　　而后,漂洗、濃縮所獲卵囊液,按照常規(guī)

4、DNA抽提法進(jìn)行球蟲全基因組DNA的提取。參照Yao-ChiSu等設(shè)計的引物:ET1:5'-CGCTGCTGGTTTTACAGGTT-3',ET2:5'-GCTGAAGCAAAGTTCCAAGC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定和聚類分析。
　　最后,將所獲柔嫩艾美耳球蟲安徽肥西(AHFX)株按照5×104個卵囊/只的劑量接種80只21d齡雛雞,分別在感染后0d、5d、9d和13d心臟采血,測定平均體重、免疫器官指

5、數(shù)和血清生化等指標(biāo)。
　　結(jié)果表明:(1)通過單卵囊分離技術(shù)感染雛雞,在20只雛雞中,有5只感染成功,其成功率達(dá)25%。(2)對單卵囊分離所獲球蟲進(jìn)行增殖,其第二代卵囊大小為(17.0~23.6)μm×(15.8~20.3)μm,平均大小為21.1μm×18.0μm,卵形指數(shù)為1.17,潛在期為140h。將單卵囊所得球蟲(第一代)與增殖后球蟲(第二代)的球蟲卵囊大小進(jìn)行差異顯著性檢驗(F檢驗),結(jié)果顯示差異不顯著(P>0.05),

6、表明第二代球蟲與第一代球蟲卵囊大小相同,且各項其他形態(tài)學(xué)特征均符合柔嫩艾美耳球蟲的特征。因此初步鑒定本次所獲球蟲為柔嫩艾美耳球蟲,暫命名為柔嫩艾美耳球蟲安徽肥西(AHFX)株。(3)應(yīng)用PCR方法,對所獲球蟲卵囊進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,成功擴(kuò)增出463bp的特異性片段;通過序列分析發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增的基因與已報道的柔嫩艾美耳球蟲(GQ856310)同一基因片段的同源性高達(dá)98.2%,并將測得序列上傳至GenBank,序列登錄號為JX477100。(

7、4)用所獲球蟲卵囊進(jìn)行雛雞接種試驗顯示:與對照組相比,感染后第5d平均體重、血清Na、TP和ALB含量極顯著降低(P<0.01),血清Ca、GOT、LDH-L和IgA的含量或活性極顯著升高(P<0.01),血清K、GPT和NO含量或活性顯著升高(P<0.05),血清CAT活性顯著降低(P<0.05);第9d時,平均體重和血清ALB含量極顯著降低(P<0.01),血清IgG含量極顯著升高(P<0.01),血清GSH-Px、T-SOD和TP

8、活性或含量顯著降低(P<0.05);第13d時,平均體重和血清T-SOD活性極顯著降低(P<0.01),胸腺指數(shù)、血清CAT、TP的活性或含量顯著降低(P<0.05),血清Ca含量顯著升高(P<0.05);整個試驗過程中,脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)、血清P、Mg、ALP和IgM的含量或活性均未表現(xiàn)出明顯變化(P>0.05)。
　　綜上所述,本研究應(yīng)用單卵囊分離技術(shù)成功分離到一株艾美耳球蟲,并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行了鑒定,確定