腸炎沙門氏菌T3SS效應(yīng)蛋白相關(guān)基因缺失突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)能夠感染人和動(dòng)物，是常見的人畜共患病原體。由SPI-1和SPI-2編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)是沙門氏菌致病重要的毒力因子，不同T3SS的效應(yīng)蛋白在細(xì)菌致病的各個(gè)階段發(fā)揮不同的作用。目前對(duì)這些效應(yīng)蛋白的研究主要是以鼠傷寒沙門氏菌為模型的，但它們?cè)诓煌逍蜕抽T氏菌中的功能可能不一致。本研究選取了在腸炎沙門氏菌T3SS的6個(gè)效應(yīng)蛋白基因，采用λRed同源重組法構(gòu)建相應(yīng)的缺失株，

2、初步探討了這些效應(yīng)蛋白與致病性的關(guān)系，為進(jìn)一步深入研究腸炎沙門氏菌感染過程中T3SS效應(yīng)蛋白的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　1.腸炎沙門氏菌T3SS效應(yīng)蛋白的原核表達(dá)和多克隆抗體的制備
　　通過PCR擴(kuò)增效應(yīng)蛋白SspH2、SIrP、SseL的完整基因序列，分別克隆至兩種不同的原核表達(dá)載體pET-32a(+)和pGEX-6p-1，構(gòu)建pET-32a-SspH2、pET-32a-SIrP和pET-32a-SseL以及pGEX-6p

3、-1-SspH2、pGEX-6p-1-SlrP和pGEX-6p-1-SseL的重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE的結(jié)果分析，這六種重組蛋白均能夠表達(dá)，并且蛋白大小與預(yù)期一致?？扇苄苑治鼋Y(jié)果顯示，六種融合蛋白部分存在于細(xì)菌的裂解上清中。將純化后的GST融合蛋白免疫家兔，以His標(biāo)簽融合蛋白為抗原的間接ELISA法檢測(cè)免疫后的效價(jià)情況，結(jié)果顯示三免14天后獲得了針對(duì)SspH2、SlrP、SseL蛋白的高效

4、價(jià)抗血清。
　　2.腸炎沙門氏菌T3SS效應(yīng)蛋白相關(guān)基因缺失株的構(gòu)建
　　以一株腸炎沙門氏菌C50041為母本，采用Red同源重組法構(gòu)建SspH2、PigB、SseL、SopE2、SlrP和SipB這6個(gè)基因的缺失突變株，PCR擴(kuò)增以及突變株序列測(cè)序結(jié)果證明了這6個(gè)基因突變株的構(gòu)建成功。使用第一章中制備的SspH2、SlrP和SseL融合蛋白的抗血清作為一抗，通過Western-blot的方法對(duì)缺失株的這三種蛋白的表達(dá)情況進(jìn)

5、行檢測(cè)，結(jié)果顯示△SspH2、△SseL和△SlrP檢測(cè)不到相應(yīng)的效應(yīng)蛋白，其它基因的缺失對(duì)這三種蛋白的表達(dá)不產(chǎn)生影響。細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線和血清殺菌結(jié)果顯示，這些效應(yīng)蛋白基因的缺失對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)速度無明顯影響，細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)和滲透性也未發(fā)生明顯的改變。
　　3.腸炎沙門氏菌T3SS效應(yīng)蛋白的致病作用
　　對(duì)野生株C50041和△SopE2、△SipB、△PipB、△SseL、△SspH2、△SlrP缺失株進(jìn)行HeLa細(xì)胞的黏附和侵

6、入試驗(yàn)以及HD11巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn)。結(jié)果顯示，與野生株和其它基因缺失株相比，△SipB缺失株的黏附和侵入能力出現(xiàn)了較為顯著的下降，而SseL基因的缺失，使得C50041對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附和侵入能力得以增強(qiáng)。巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn)中，各組細(xì)菌的增殖率無明顯變化。細(xì)菌侵入HeLa細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子表達(dá)水平的結(jié)果顯示，IFN-γ、TNF-α以及IL-18的表達(dá)水平差異不明顯，而△SspH2在侵入HeLa細(xì)胞6h時(shí)，IL-8的表達(dá)水平顯著

7、高于野生株;△PipB在侵入HeLa細(xì)胞6h時(shí)，IL-1β的表達(dá)水平顯著高于野生株C50041。1日齡雛雞致死性試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺失株△SipB、△SseL和△SlrP的LD50均高于野生株C50041，其中△SipB缺失株的毒力下降最為明顯;而缺失株△PipB、△SopE2和△SspH2的LD50均低于野生株C50041，特別是△SspH2缺失株的毒力增強(qiáng)最明顯。
　　本文成功構(gòu)建了腸炎沙門氏菌6個(gè)效應(yīng)蛋白基因的缺失株，缺失效應(yīng)蛋