不同食性家蠶品種(品系)3個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)特征分析.pdf

1、家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,用人工飼料養(yǎng)蠶是今后養(yǎng)蠶業(yè)發(fā)展的方向,但目前我國飼養(yǎng)的蠶品種對人工飼料的攝食性多數(shù)達(dá)不到實(shí)用化要求,成為制約該技術(shù)推廣的主要障礙,提高家蠶對人工飼料的攝食性和適應(yīng)性是一項(xiàng)重要的研究課題。前人已經(jīng)從通遺傳學(xué)角度對食性遺傳模式進(jìn)行了很多研究,但在分子生物學(xué)水平上食性差異的機(jī)理尚不清楚,目前尚未發(fā)現(xiàn)所謂的“食性基因”。
　　本研究室利用人工飼料育系統(tǒng)選擇方法,經(jīng)過連續(xù)多代選擇,選育出對人工飼料攝食性存在很大差異

2、的家蠶品種、品系,并構(gòu)建了不同攝食性蠶品種Long-SAGE文庫。本研究從不同攝食性家蠶SAGE文庫數(shù)據(jù)分析入手,發(fā)掘了一條家蠶假定表皮蛋白基因BmCph2(cuticular protein hypothetical 2)和兩條家蠶多藥耐藥蛋白基因BmMrp1(Multidrug resistance-associated protein 1)和BmMrp2(Multidrug resistance-associated protei

3、n 2)。采用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,對以上3個(gè)基因在不同食性蠶品種和品系中的表達(dá)特征進(jìn)行了研究。主要獲得如下結(jié)果:
　　1.對BmCph2基因進(jìn)行染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析表達(dá),該基因位于家蠶2號染色體的nscaf2964,具有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。BmCph2全長770bp,最大開放閱讀框648bp,編碼216個(gè)氨基酸。RT-PCR檢測5齡3日BmCph2基因的組織表達(dá)特異性顯示,該基因在幼蟲頭部,體壁及中

4、腸中高表達(dá),其次為精巢和絲腺,在卵巢、脂肪體和血液中表達(dá)量較低。
　　2.以廣食和魯七的全蠶、頭部及消化管為材料,分別測定BmCph2基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)活性。結(jié)果表明,全蠶中該基因在胚胎期和各齡將眠期表達(dá)活性很低,在眠期和起蠶時(shí)高表達(dá),頭部與全蠶的表達(dá)特征基本一致,但在中腸中表達(dá)活性較低,而且表達(dá)時(shí)間比全蠶和頭部提前,因此推測,該基因的表達(dá)可能與家蠶新表皮的形成有關(guān)。另外,BmCph2基因在不同食性蠶品種中的表達(dá)活性存在差異

5、,其中在全蠶和頭部中幾個(gè)高表達(dá)期,均是對人工飼料攝食性差的魯七品種中顯著高于攝食性好的廣食品種,而在中腸中的表達(dá)活性則是廣食高于魯七。
　　3.以對人工飼料攝食性好的廣食(3齡起蠶)、菁松A、B高食系(2齡起蠶)及攝食性差的魯七(3齡起蠶)和菁松A、B低食系(2齡起蠶)為材料,分別用桑葉、人工飼料、薄荷油、樟腦丸進(jìn)行氣味刺激或取食刺激15-60min,然后檢測全蠶中BmCph2基因表達(dá)活性的變化。結(jié)果表明,高食性蠶總體上對刺激的反

6、應(yīng)比較敏感,多數(shù)處理后基因表達(dá)下調(diào),會在少數(shù)處理后表達(dá)上調(diào)或無顯著影響,但氣味和取食刺激對低食性蠶BmCph2基因表達(dá)影響較小,除魯七品種部分處理后表達(dá)下調(diào)外,多數(shù)處理后與對照不存在顯著差異,尤其是菁松A、B低食系幾乎不受影響。本試驗(yàn)結(jié)果說明,BmCph2基因除參與表皮形成之外,還與家蠶的食性有密切關(guān)系,其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　4.對BmMrp1和BmMrp2進(jìn)行基因定位和結(jié)構(gòu)分析表明,兩個(gè)基因均定位于15號染色體的nsc

7、af2887,cDNA長度分別為5170bp和4345bp,最大ORF序列相同,均為3807bp,且均含有26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子,具有很大的同源性,特別是中間部分的序列幾乎完全相同,只有在兩基因的首尾存在差異。利用RT-PCR檢測大造品種5齡3日家蠶幼蟲不同組織中兩基因的表達(dá)活性,結(jié)果顯示,BmMrp1&2在中腸和精巢中高表達(dá),其次為卵巢和絲腺,在其他組織中幾乎檢測不到表達(dá)。
　　5.以對人工飼料攝食性不同的蠶品種、品系為材料

8、,測定不同齡期BmMrp1和2兩基因的共同表達(dá)即各自的表達(dá)情況。結(jié)果表明,在3齡起蠶BmMrp1&2的共表達(dá)及各自的表達(dá)活性,均是高食性的廣食品種顯著低于低食性的魯七,在2齡起蠶,不同食性品系菁松A的BmMrp1、不同食性品系菁松B的BmMrp1&2共表達(dá)以及BmMrp2的表達(dá)活性也是高食性品系低于低食性品系,而在2齡起蠶,不同食性菁松A的BmMrp1&2的共表達(dá)及BmMrp2的表達(dá),菁松B不同品系BmMrp1的表達(dá),以及蟻蠶期菁松A和

9、菁松B不同品系,BmMrp1&2的共表達(dá)活性,均是高食性品系高于低食性品系;廣食和魯七的蟻蠶期兩基因的表達(dá)無顯著性差異。可見BmMrp1和BmMrp2基因在不同食性蠶體中的表達(dá)沒有統(tǒng)一規(guī)律性。
　　6.飼料氣味、取食刺激及忌避劑刺激對BmMrp1&2的共表達(dá)及各自的表達(dá)活性均有顯著影響,即存在誘導(dǎo)表達(dá)現(xiàn)象,但對不同食性的品種、品系及同一品系不同發(fā)育階段的影響是不同的。從總體統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看,桑葉氣味和取食桑葉刺激對該基因表達(dá)的影響存在

10、大致相似的趨勢:對高食性蠶(品種和品系)這兩個(gè)基因的共表達(dá)以下調(diào)為主,而對低食性蠶則以上調(diào)居多。但對其中一個(gè)基因的誘導(dǎo)表達(dá)與兩基因的共表達(dá)不同,而且無統(tǒng)一規(guī)律性。人工飼料氣味和取食飼料刺激對該基因的表達(dá)也存在相似的影響,無論是對高食性蠶還是低食性蠶,這兩個(gè)基因的共表達(dá)均以上調(diào)為主,而對其中一個(gè)基因表達(dá)的影響則以下調(diào)為主。忌避劑薄荷油和樟腦的氣味刺激對BmMrp1&2的表達(dá)也有不同程度的影響,但薄荷油的影響總體上比樟腦的影響小,而且未發(fā)現(xiàn)