水稻類囊體腔蛋白OsTLP27及顯性OsDET1基因的功能分析研究.pdf

1、葉綠體是藻類和高等植物光合反應的場所,是由包圍可溶基質的被膜和高度特化的類囊體膜組成。由類囊體膜包圍的是一個狹窄連續(xù)的整體空間,叫做類囊體腔。自從菠菜的類囊體腔蛋白質組被首次分離鑒定后,人們對這個亞細胞器在光合作用的調節(jié)和保護功能的研究越來越多。蛋白質組學研究預測擬南芥類囊體腔含有80-200個蛋白。這些蛋白分別具有光合電子傳遞、放氧、蛋白折疊、蛋白酶等生物學功能,表明類囊體腔在光合結構的進化、優(yōu)化、累積和修復等過程中,可以保證其自身在

2、多變和脅迫環(huán)境下正常運轉。后又發(fā)現在類囊體腔具有核酸代謝和氧化還原調節(jié)方面的證據,就更加豐富了類囊體腔的功能,人們對這個亞細胞器功能的認識也越來越深刻。但到目前為止,在水稻中對類囊體腔相關蛋白功能研究的報道只有兩個:在擬南芥和煙草中異源表達OsCYP20-2和FKBP16-3可提高植株對非生物環(huán)境脅迫的能力。因此,研究水稻類囊體腔蛋白的功能對豐富水稻基因功能研究將會具有重要意義,同時也有可能會發(fā)現一些對水稻育種方面有價值的基因。

3、　　在本研究中,我們鑒定了一個與擬南芥AtTLP具有53％同源性的水稻類囊體腔蛋白OsTLP27(OryzasativaThylakoidlumenprotein,27kDa),含有257aa,理論分子量為27kDa。通過反向遺傳學手段和生理生化分析對該蛋白進行了系統(tǒng)的研究,主要結論如下:
　?、貽sTLP27基因編碼一個擬南芥類囊體腔蛋白同系物(AtTLP),蛋白含有一個DUF1499結構域;
　　生物信息學分析表明OsT

4、LP27的同源基因在高等植物中廣泛分布,可見該基因在植物生長發(fā)育中的作用十分重要。聚類分析表明單子葉和雙子葉TLP蛋白在進化分析樹中存在兩個分支。BLAST序列比對發(fā)現OsTLP27與擬南芥類囊體腔蛋白基因AtTLP(At4g24930)具有53%的同源性。OsTLP27基因在親緣關系上,相比雙子葉植物,與單子葉植物進化關系更近。在植物質體數據庫(PPDB)中搜索OsTLP27,發(fā)現其蛋白N端含有一個50aa的葉綠體轉移肽和一個DUF1

5、499結構域,可見OsTLP27的功能有待深入研究。
　?、贠sTLP27主要在葉片和葉鞘等綠色組織中表達,且受節(jié)律控制;
　　利用定量PCR檢測了OsTLP27在日本晴不同組織中的表達,這其中包括苗期葉片,分蘗期葉片和根,抽穗期葉片、葉鞘、根和花器官、成熟期葉片、葉鞘、莖和幼胚,結果顯示OsTLP27主要在綠色組織中表達,表明其可能參與光合作用。利用半定量RT-PCR檢測了OsTLP27在24h光照/24h黑暗條件下mRN

6、A水平,結果表明OsTLP27在葉片中的表達受到節(jié)律控制。
　?、跲sTLP27是一個類囊體腔外周蛋白。
　　構建了35S::OsTLP27-GFP融合表達載體,瞬時轉化煙草原生質體,利用激光共聚焦顯微鏡觀察亞細胞定位的瞬時表達綠色熒光,結果表明OsTLP27定位于葉綠體中。利用葉綠體subfraction標記蛋白抗體和OsTLP27特異抗體研究OsTLP27在葉綠體subfraction上的定位,結果表明OsTLP27存在

7、于類囊體膜上。酶保護實驗表明OsTLP27錨定在類囊體膜外周(腔側)。
　?、苓^表達OsTLP27增強水稻光化學效率并重塑葉綠體結構;
　　OsTLP27超表達提高轉基因植株葉綠素含量并增強其光化學效率。最大光化學效率(Fv/Fm)、PSII量子產額(ΦPSII)、電子傳遞率(ETR)和光化學淬滅(qP)等都增強;過表達還導致葉綠體相關基因的轉錄水平升高,基粒個數增多并且結構變大,光復合體組成形式也因此發(fā)生了變化;
　

8、?、軴sTLP27間接參與水稻光合作用;
　　OsTLP27的RNA干擾研究表明轉基因植株的光合作用受阻,Westernblot結果表明參與光合作用的蛋白積累受到影響。當轉基因植株在含有蔗糖的培養(yǎng)基上生長時表型無明顯變化,但當轉移到土壤中生長一段時間后,植株表型矮小,葉色偏黃。如果OsTLP27的轉錄水平低于野生型20%,干擾植株不能在土壤中存活。
　?、轔sTLP27可能具有分子伴侶功能;
　　酵母雙雜交分析表明Os

9、TLP27與核糖體轉運RNA蛋白RpL31和一個醛酮氧化還原酶(Aldo-ketooxidoreductase)家族蛋白(AKRFP)相互作用。以OsTLP27誘餌質粒篩選酵母文庫,共篩選到兩個存在相互作用的蛋白:RpL31和AKRFP蛋白。酵母共轉化實驗進一步表明了OsTLP27蛋白與RpL31和AKRFP蛋白存在相互作用。構建熒光雙質粒共侵染洋蔥表皮細胞,發(fā)現OsTLP27蛋白與RpL31和AKRFP蛋白確實是在生物體內(inviv

10、o)發(fā)生了相互作用。因此基于互作蛋白分析,我們推測OsTLP27可能作為一個分子伴侶參與AKRFP的質體轉運。
　　這些結果表明OsTLP27是一個影響葉綠素體結構和功能的新蛋白。
　　OsDET1保守區(qū)單個氨基酸改變和其轉錄水平的提高導致了水稻高葉綠素含量的表型。但是它的功能獲得型突變(gain-of-function)對突變體生理水平上的影響還需要系統(tǒng)研究。在本文中,我們對突變體的生理生化特性進行了研究分析,以下是主要發(fā)