新生仔豬肝臟mRNA與miRNA表達(dá)譜的品種差異及糖皮質(zhì)激素的作用.pdf

1、不同品種的豬性狀差異顯著，為動(dòng)物基因組的研究提供了很有價(jià)值的模型。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)二花臉豬(Erhualian，EHL)和大白豬(LargeWhite，LW)各種代謝指標(biāo)差異顯著，推測(cè)可能與糖皮質(zhì)激素水平的差異有關(guān)。肝臟是機(jī)體最重要的代謝器官之一，肝細(xì)胞富含線粒體，而線粒體氧化磷酸化是生成ATP的重要途徑，因此肝臟決定了機(jī)體的能量穩(wěn)態(tài)和代謝類型。二花臉豬和大白豬具有截然不同的代謝類型，但對(duì)兩品種豬肝臟mRNA表達(dá)譜差異的研究卻所知甚少

2、。小RNA(microRNA，miRNA)是近年來研究的熱點(diǎn)，miRNA可以通過靶向3'非翻譯區(qū)(3'untranslatedregions，3'UTR)序列促進(jìn)靶基因mRNA降解或抑制翻譯，從而調(diào)控功能基因的表達(dá)。肝臟代謝相關(guān)的功能基因也受miRNA的調(diào)控，但豬肝臟miRNA表達(dá)譜是否存在品種差異，是否與肝臟mRNA表達(dá)譜的品種差異相關(guān)聯(lián)，均未見報(bào)道。糖皮質(zhì)激素對(duì)肝臟代謝有重要作用，豬肝臟差異表達(dá)的mRNA和miRNA是否與糖皮質(zhì)激素

3、有關(guān)，糖皮質(zhì)激素是否影響豬肝臟miRNA生成通路，尚屬未知。研究表明，糖皮質(zhì)激素受體可轉(zhuǎn)位到線粒體中調(diào)節(jié)線粒體基因的轉(zhuǎn)錄，不同品種豬血清糖皮質(zhì)激素水平的差異是否會(huì)導(dǎo)致肝臟線粒體基因轉(zhuǎn)錄的差異，也仍屬未知。故而，本實(shí)驗(yàn)的目的是將二花臉和大白豬肝臟中差異表達(dá)的miRNA和mRNA進(jìn)行共分析，從而揭示其與代謝指標(biāo)之間的關(guān)系;并探討豬肝臟線粒體基因轉(zhuǎn)錄和miRNA生成過程的品種差異是否與糖皮質(zhì)激素有關(guān)。
　　1新生仔豬肝臟miRNA和mR

4、NA表達(dá)譜共分析
　　miRNA參與肝臟的各種代謝過程，發(fā)揮調(diào)控作用，然而我們對(duì)品種特異性的miRNA表達(dá)及其與mRNA表達(dá)之間的關(guān)系知之甚少。我們選用具有明確代謝特征差異的兩個(gè)品種——大白和二花臉的新生雄性仔豬，使用芯片（microarray）進(jìn)行了mRNA表達(dá)譜的研究，使用芯片和深度測(cè)序進(jìn)行了miRNA表達(dá)譜的研究，并且將miRNA與mRNA表達(dá)進(jìn)行了共分析，以揭示其與生理生化指標(biāo)之間的關(guān)系。與大白豬相比，二花臉新生仔豬肝臟有

5、30個(gè)上調(diào)和18個(gè)下調(diào)miRNA，298個(gè)上調(diào)和510個(gè)下調(diào)的mRNA。對(duì)部分差異表達(dá)miRNA的RT-PCR檢測(cè)也確證了高通量分析的結(jié)果。使用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)算法，我們發(fā)現(xiàn)在二花臉豬中上調(diào)的miRNA與下調(diào)的mRNA之間存在顯著的相關(guān)性。對(duì)蛋白水解過程中差異表達(dá)基因的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，這個(gè)過程是被miRNA調(diào)控的。二花臉豬血清中大部分游離氨基酸的含量都顯著低于大白豬，這可能與二花臉豬肝臟蛋白水解能力較低有關(guān)。
　　以上結(jié)果為豬肝臟的miRNA和

6、mRNA表達(dá)譜研究提供了新的信息，為揭示豬品種間特異性性狀產(chǎn)生的分子機(jī)制提供了新的線索，也為之后豬肝臟miRNA的功能研究打下基礎(chǔ)。
　　2糖皮質(zhì)激素處理的肝臟表達(dá)譜的分析
　　二花臉新生仔豬血清糖皮質(zhì)激素（皮質(zhì)醇）含量是大白豬的2倍。為了研究糖皮質(zhì)激素對(duì)肝臟mRNA表達(dá)譜的影響，我們選取了9個(gè)GEO上標(biāo)注比較完備的地塞米松處理的肝臟表達(dá)譜并篩選了差異表達(dá)基因。其中7個(gè)表達(dá)譜中下調(diào)基因的數(shù)目大于上調(diào)，僅有兩個(gè)與之相反。但是在

7、篩選這些表達(dá)譜中共有的差異表達(dá)基因時(shí)，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，上調(diào)基因占差異表達(dá)基因的比重逐漸增高，這些可能說明了地塞米松對(duì)肝臟基因表達(dá)的抑制作用是非特異的。
　　將地塞米松處理的肝臟表達(dá)譜的上調(diào)和下調(diào)基因分別與二花臉和大白豬的肝臟表達(dá)譜的差異表達(dá)基因相比較，僅發(fā)現(xiàn)地塞米松下調(diào)的肝臟基因與二花臉豬肝臟下調(diào)基因的交集顯著高于背景值。
　　使用在9個(gè)表達(dá)譜中存在至少三次重復(fù)的上調(diào)基因（178個(gè)）和下調(diào)基因(176個(gè))進(jìn)行GO分析。對(duì)

8、糖皮質(zhì)激素處理后肝臟中上調(diào)基因的生物學(xué)過程的分析和對(duì)全部差異表達(dá)基因的分析結(jié)果有很大的相似度，但是與下調(diào)基因的生物學(xué)過程分析結(jié)果有很大不同。這說明只有糖皮質(zhì)激素上調(diào)的基因顯著的被富集在某些生物學(xué)通路之中，代表了糖皮質(zhì)激素對(duì)肝臟的一般功能。在細(xì)胞組分的分析中，可以發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素所上調(diào)的基因最富集的條目是“線粒體”。
　　3糖皮質(zhì)激素對(duì)新生仔豬肝臟線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控
　　線粒體是真核細(xì)胞的重要組分，對(duì)代謝旺盛的組織如肝

9、臟有著極為重要的作用。不同品種的豬肝臟代謝差異顯著，糖皮質(zhì)激素可能通過影響線粒體功能調(diào)控肝臟代謝，所以我們進(jìn)而研究了糖皮質(zhì)激素與豬肝臟線粒體功能品種差異的關(guān)系。
　　我們比較了大白和二花臉新生仔豬肝臟線粒體基因調(diào)控的品種差異。二花臉豬肝臟ATP含量顯著高于大白豬(p＜0.01)，而線粒體DNA的拷貝數(shù)顯著低于大白豬(p＜0.05)。然而，二花臉豬中大部分線粒體編碼基因（13個(gè)中的10個(gè)）的表達(dá)高于大白豬。另外，我們檢測(cè)了三個(gè)核編碼

10、的線粒體相關(guān)基因的表達(dá)，其中二花臉豬肝臟中異檸檬酸脫氫酶2(isocitratedehydrogenase2，IDH2)和ATP合成酶線粒體質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)Fo復(fù)合物d亞基(ATPsynthase，H+transporting，mitochondrialFocomplex，subunitd，ATP5H)的表達(dá)較低，而腺苷酸激酶1（adenylatekinase1，AK1）的表達(dá)高于大白豬。二花臉豬線粒體基因調(diào)控區(qū)域糖皮質(zhì)激素受體（glucoco

11、rticoidreceptor,GR）結(jié)合顯著高于大白豬(p＜0.01)，這與肝臟線粒體編碼基因的高表達(dá)是相關(guān)的，而線粒體基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平不存在品種差異。對(duì)于核編碼基因來說，AK1和ATP5H啟動(dòng)子區(qū)域的GR結(jié)合與其mRNA表達(dá)方向相反。另外，二花臉豬中高表達(dá)的AK1也與其啟動(dòng)子區(qū)域較低的甲基化(p＜0.05)和羥甲基化水平(p＜0.05)相關(guān)。
　　綜上所述，GR對(duì)線粒體基因組編碼基因起到了正向的調(diào)控作用，而對(duì)核編碼基

12、因ATP5H和AK1的調(diào)節(jié)則是負(fù)向的，這些調(diào)控作用可能對(duì)兩品種豬肝臟ATP含量的差異有較大的貢獻(xiàn)。
　　4糖皮質(zhì)激素對(duì)新生仔豬肝臟miRNA生成關(guān)鍵酶的調(diào)控
　　從兩品種新生仔豬肝臟miRNA測(cè)序和芯片結(jié)果都可以看出，與大白豬相比，二花臉仔豬肝臟上調(diào)的miRNA數(shù)目多于下調(diào)的miRNA，并且miRNA測(cè)序庫中二花臉豬總的讀段數(shù)多于大白豬。這些都提示二花臉豬肝臟miRNA生成過程關(guān)鍵酶的功能可能高于大白豬。
　　我們比較

13、了大白和二花臉新生仔豬肝臟中Drosha，Dicer和Ago2的mRNA和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二花臉豬中這三個(gè)miRNA生成過程關(guān)鍵酶的蛋白表達(dá)都顯著高于大白豬，而mRNA水平則不存在差異。對(duì)這三個(gè)酶轉(zhuǎn)錄層次的調(diào)控因素進(jìn)行分析顯示，這三個(gè)酶啟動(dòng)子區(qū)域的GR結(jié)合，環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMPresponsiveelement-bindingprotein，CREB)結(jié)合，甲基化和羥甲基化情況都不存在差異。這些因素表明，對(duì)這三個(gè)酶表達(dá)的調(diào)控

14、可能主要集中在轉(zhuǎn)錄后層面。作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控重要組成部分的miRNA，可能對(duì)其自身生成有著很重要的影響。
　　通過實(shí)證靶點(diǎn)數(shù)據(jù)與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)信息，我們選取了四個(gè)(miR-15b，miR-27a，miR-221與miR-222)在二花臉豬肝臟中低表達(dá)的，靶向與miRNA生成過程關(guān)鍵酶的miRNA進(jìn)行進(jìn)一步研究。糖皮質(zhì)激素對(duì)miRNA生成過程關(guān)鍵酶表達(dá)的調(diào)節(jié)作用在淋巴細(xì)胞上有過證明。這四個(gè)miRNA也都可能是糖皮質(zhì)激素敏感的miRNA，在糖皮

15、質(zhì)激素處理的情況下可能發(fā)生變化。我們使用real-timePCR驗(yàn)證了這四個(gè)miRNA成熟體和前體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-15b和miR-221/222的前體和成熟體在二花臉豬肝臟中的表達(dá)都顯著低于大白豬。對(duì)這幾個(gè)miRNA的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析可以發(fā)現(xiàn)，二花臉豬肝臟GR對(duì)miR-15b和miR-221/222啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合顯著高于大白，這可能與其表達(dá)降低是相關(guān)的。我們的結(jié)果表明，二花臉新生仔豬肝臟中某些糖皮質(zhì)激素敏感的miRNA的降低